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| 黄芩素的酶解提取工艺及其抑制弹性蛋白酶活性研究 |
1 前言
弹性蛋白酶是一种广泛存在于动物胰脏中的内肽酶，具有降解胶原蛋白、弹性蛋白等多种蛋白
质的能力。在体内，当弹性蛋白酶与天然抑制剂的平衡被破坏后，酶活力增加，这是诱发包括肺气肿
在内的多种疾病的病因之一。据报道n]连翘、黄芩、丹参等中草药的水提取物均具有抑制弹性蛋白
酶的作用，但对其有效成分的研究尚未见进一步的研究报道。黄芩素是中药黄芩的主要有效成分之
一
，为黄酮类化合物。本文研究了酶解法从黄芩中提取黄芩素的条件，并利用酶活力测定法，研究黄
芩素对猪胰弹性蛋白酶(PPE)的抑制作用。
2 实验部分
2．1 仪器与试剂
KQ3200超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；7200分光光度计(四川分析仪器厂)；
TGL一16C型台式离心机(上海安亨科学仪器厂)；中草药黄芩(市售)；95 乙醇(it京化工厂)；黄芩
素用含有4O 的二甲基亚砜的水溶液溶解，浓度为4．05mg／mI ；刚果红一弹性蛋白：德国Sigma试’
剂，德国分装；猪胰弹性蛋白酶(酶活力为14．3S．U／mg)：常州生化千红制药有限公司；0．02mol／L
硼酸缓冲液(pH8．8)：取0．05mol／I 硼酸液142．8mI 与0．05mol／I 硼砂液57．2mI 混合，加蒸馏
水至500mI ；0．5mol／I 磷酸缓冲液(pH6．0)：取0．5mol／I Na2HPO4液29．4mI 与0．5mol／I
KH PO 液470．6mI 混合；其他试剂为分析纯。
2．2 方法与结果
2．2．1 酶解工艺考察
2．2．1．1 酶解实验
称取10g粉碎的黄芩根粉，加50mI 蒸馏水，根据正交表中条件进行酶解后弃滤液。将滤渣用
95 的乙醇浸泡提取，抽滤，滤液定容至50mI 。采用L。(3。)正交试验法对黄芩素提取中酶解条件
进行了优选如表1。
2．2．1．2 结果及方差分析
参照黄芩素含量测定方法[33，以此为考察指标。正交试验测定结果见表2，方差分析见表3。
由表1—3各因素对酶解工艺的影响，最大为酶解温度，其次是时间及pH值。过酸会使酶、底
物或酶一底物复合物发生电离，而破坏酶的活性；且由方差分析可知三个pH对含量影响不大。从
而推断工艺条件为 B。C。，即酶解温度为40℃ 、pH值6．0、时间是12h，提取液中黄芩素含量最高。
2．2．2 黄芩素体外抑制弹性蛋白酶活性研究
酶活力测定原理[4 ：在最适合的条件下分析弹性蛋白酶对底物刚果红一弹性蛋白的水解活力，
用比色法测定进入水解液中的色素量表示活性，将每120min水解底物lmg所需酶量定为一个弹
性活性单位。
2．2．2．1 供试液配制
准确称取弹性蛋白酶适量，加适量pH8．8硼酸缓冲液，使酶全部溶解后，定容，使所配制的溶
液每毫升含2．5—3．0弹性蛋白酶单位。
2．2．2．2 抑制酶活性测定
取5个容量瓶，分别加人准确称取的刚果红一弹性蛋白20mg，空白加入pH8．8硼酸缓冲液
3．0mI ，样品瓶加入3．0mL预热至37℃的供试液，再加入不同体积的黄芩素的溶液，混匀。置摇床
中37 C充分震荡，准确保温20min，然后各瓶中加入杀酶剂磷酸缓冲液5．0mL，离心2000rpm，
20min取上清液4．0mI 分别置于另外试管中，各管均加入1．0mL pH8．8硼酸缓冲液、pH6．0的磷
酸缓冲液5．0mL，摇匀，于495nm测定吸光度。根据方程 一[(1一A／Ao)×1003计算抑制率；其
中： —— 加入抑制剂后的吸光度值；A。—— 总的吸光度值。结果见表4。
结果表明黄芩素对刚果红弹性蛋白酶具有抑制作用，且黄芩素抑制能力与浓度呈明显的量效
关系。
3 结呆与讨论
影响酶解效果的因素[62很多，主要有温度、酸碱度和时间。温度对酶活力的影响是对酶蛋白结
构的稳定性和反应速度综合作用的结果，在一定的范围内，温度升高，反应速度加快；但当温度超过
一定程度时，又促进了酶蛋白的变性反应，因此所有的酶都有一个最适的温度范围，大多植物组织
的酶在50 C时活力最大。酶是两性化合物，过酸或过碱会使酶、底物或酶一底物复合物发生电离，
引起pH值改变，从而造成酶的活性及稳定性发生变化，甚至破坏酶的活性，因此酶都有其最适的
pH值，植物组织中酶的最适pH值为4．o～6．5。有研究报道黄芩根在水中浸泡3h，黄芩苷约有
62．5 一93．7 水解成苷元，故本实验选取酶解时间为6、12和24h是合理的。
黄酮类化合物对酶有抑制作用也是基于多酚与蛋白质的反应。20世纪8O年代中期Haslam等
人对多酚一蛋白质反应机理进行了科学的总结，提出多酚类物质的大量酚羟基与蛋白质主链的
一NH—cO，侧链上的一OH、一NH 以及一cO0H以氢键的形式多点结合，同时具有“手套一手”反
应模式，对蛋白质分子具有选择性。反应历程是植物多酚先通过疏水键向蛋白质分子表面靠近，多
酚分子进入疏水袋，然后发生多点氢键结合[72。本实验研究表明：黄芩素对弹性蛋白酶具有明显抑
制作用。这对有效合理利用和开发中药黄芩有一定的参考价值。其作用机理及在体内是否仍具有
活性仍需进一步深入研究。
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