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| RP-HPLC内标法测定双黄连注射液中黄芩苷的含量 |
双黄连注射液是由金银花、连翘、黄芩3味中药提取物组成的复合制剂，适用于病毒及细菌所致的上呼
吸道感染、肺炎、扁桃体炎、咽炎等，具有良好疗效．其中黄芩苷含量为其重要控制指标之一，薄层扫描法是
2000版药典黄芩苷的含量测定方法．该法较紫外分光光度法简便，但重现性差，展开后黄芩苷斑点在聚酰胺
薄膜上往往难以定位，有拖尾现象．文献报道可用分光光度法测定_】 ]，由于处方中其他成分在测定波长
(280 nm)处有吸收，影响含量测定的准确性．本文以水杨酸为内标物，建立了一种不需对样品进行繁杂前处
理的反相高效液相色谱测定双黄连注射液中黄芩苷含量的方法．该法具有操作简便、快速、灵敏、可靠的特点，可用于于双黄连注射液产品的质量检测．
1 实验部分
1．1 仪器及试剂
Shimadzu LC一6A 高压液相输液泵(Kyoto，Japan)；Shimadzu SPD-6AV 可变波长紫外可见检测器
(Kyoto，Japan)；Rheodyne(USA)型进样阀；Shimadzu C—R3A 数据处理机．
黄芩苷标准物由中国药品生物制品检定所提供；双黄连注射液(乌苏里江制药厂，批号2006012014)；色
谱纯级的甲醇购自美国Fisher(Springfield)公司和天津第二试剂公司；标准溶液和样品溶液的制备均使用
三次蒸馏水，其他试剂(特别标明的除外)均为分析纯．
1．2 色谱条件
色谱柱：shim-pack CI C—ODS柱(5 m，150 mm × 6．0 mm)；流动相：甲醇一水( (甲醇)：V(水)一
60：40)，流动相使用前用0．45 tLm 的滤膜过滤并超声脱气；磷酸调节pH 一3．5；流速l_0 mL／min；检测波
长280 nm；柱温：室温．在此色谱条件下，水杨酸、黄芩苷的保留时间分别为2．9，6．7 min．
1．3 实验步骤
1．3．1 内标溶液的配制 准确称取水杨酸18．6 mg，溶解在500 mL容量瓶中，用流动相溶解，定容，摇匀
充分混合，制成37．2 mg／L的内标液．
1．3．2 标准溶液的配制 准确称取黄芩苷5．5 mg，用少量内标液溶解，用50 mL容量瓶定容．黄芩苷质量
浓度为110 mg／L．精密吸取黄芩苷溶液2，4，5，6，8，10，11 mL于50 mL容量瓶中，分别用内标液定容，制备
成一系列的标准溶液．
1．3．3 供试溶液的配制 精确量取双黄连注射液0．5 mL，用流动相定容至50．0 mL，取此双黄连溶液
10 mL，再用内标液稀释定容至50．0 mI ，双黄连注射液共稀释500倍，制成供试溶液．
1．3．4 标准工作曲线 选定的色谱条件下，分别取上述各标准溶液，进样2O L，记录峰面积，以黄芩苷对
水杨酸峰面积之比为纵坐标Y，以黄芩苷质量浓度为横坐标z，得黄芩苷的线性回归方程、线性范围、相关系
数．精密吸取黄芩苷标准溶液2O L，重复进样5次，记录峰面积测得精密度．
2 结果与讨论
2．1 流动相的组成
以体积比分别为20：8O，30：70，40：60，50：50，60：40，70：30的甲醇一水溶液为流动相进行实验，不
同浓度甲醇对黄芩苷的保留时间有影响，高浓度甲醇溶液使黄芩苷的保留时问提前，但与水杨酸峰不能较好
地分离．精细调配甲醇的比例，可使水杨酸峰与黄芩苷峰达到基线分离，分离度好，且其峰形尖锐、对称，选定
甲醇一水( (甲醇)：V(水)一60：40)为流动相．
2．2 pI4值的影响
用磷酸调节流动相的pH 值，研究了pH 值对分离效果的影响．分别用pH 值为2．5，3．0，3．5，4．0，4．5
的甲醇一水的流动相测定黄芩苷色谱峰的保留时间．结果随pH 值增大，黄芩苷的保留时间后移．为在尽早的
时间内实现黄芩苷在样品中与其他组分的分离，选定pH 一3．5．
2．3 检测波长的确定
对供试品及对照品在200~400 nm 内进行紫外扫描，两者均在280 nm 处有较强吸收，而阴性对照品无
干扰，结合中草药色谱分析文献[47中对检测波长的选择，考察样品在本HPLC条件下的实际吸收情况，选
定280 nm 为检测波长．
2．4 内标物的选择
内标法是结合峰面积归一法和外标法优点的一种方法，它在加入内标物后，按峰面积归一法的分析方法进行定量，避免了由于进样的一致性及样品歧视效应导致的偶然误差．它的分析精密度也是比较高的，是液
相色谱的一种比较理想的定量分析方法．通过实验发现水杨酸作为内标物比较合理，对照品的色谱图见
图1．
水杨酸与黄芩苷的结构中均有苯环、羟基、羧基等官能团，且2种物质互相不起化学反应．谱图显示：两
者分离度较好，保留时间适当，是本测定方法较理想的内标物．
2．5 线性结果
由线性回归实验得样品的回归方程为 一0．063 lx+ 0．034 3，线性相关系数为r一0．999 1，线性范围
为4．4～24．2 mg／L．可见在实验所测的质量浓度范围内，测定结果呈良好的线性．
2．6 精密度及最小检出限
由精密度实验计算水杨酸、黄芩苷的RSD(n一5)分别为0．57 ，0．46 ；以3倍信噪比计算被测物黄
芩苷的最小检出限为4．0 ng．
2．7 溶液稳定性实验
标准溶液和样品溶液的稳定性是通过在7 d内监测黄芩苷标准溶液以及双黄连注射液样品中有效成分
的峰面积变化来评价的．实验结果表明：将标准溶液和样品溶液在5℃ 左右避光储存于冰箱中，在7 d内，这
些溶液中黄芩苷的色谱峰面积没有明显的改变，也没有观察到明显的降解现象，表明标准溶液和样品溶液至
少在7 d内是稳定的．
2．8 加样回收率
取已知黄芩苷质量浓度的双黄连注射液5份，分别加入不同质量浓度的黄芩苷标准液，按样品中黄芩苷
的质量浓度测定法测定，每份平行测定3次，计算回收率，结果见表1．
2．9 样品测定结果
精密吸取样品溶液进样20 L，记录峰面积，用2峰面积结合黄芩苷线性方程，计算双黄连注射液中黄
芩苷平均质量浓度为7．32 mg／L．色谱图见图2．
3 结语
采用反相高效液相色谱内标法测定双黄连注射液中黄芩苷的含量，对色谱条件进行系统的优化选择，分
析方法简便，重现性好，灵敏度高，测定结果令人满意，可用于实验室、药监部门和工业生产中对双黄连注射
液中黄芩苷的含量测定．
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