近红外漫反射光谱法测定黄芩中总黄酮及黄芩苷的含量

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近红外漫反射光谱法测定黄芩中总黄酮及黄芩苷的含量
黄芩为唇形科多年生草本植物黄芩Scutellaria baicalen— sis Georgi的干燥根，主产于山东、山西、陕西、河北及北京等，具有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎等作用l_】]。黄酮类化合物是黄芩的主要活性成分，其中黄芩苷是黄芩中含量最高的化合物，具有抗炎、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、免疫调节等多种活性_2 ]，黄芩的质量通常采用总黄酮及黄芩苷的含量作为控制指标，2005年版药典一部是采用黄芩苷来控制的『5]。黄芩中黄酮类化合物的经典测定方法主要有高效液相法¨6 ]，紫外分光光度法l_8]等，但上述方法分析耗时较长，运行和维护成本较高。在中药企业生产及中药材品种选育过程中，经常需要大批量样品的快速分析，这是传统分析方法难以实现的。近年来迅速发展的近红外光谱(NIRS)分析技术具有快速、无损、原位与无污染等特点，为中药质量的快速分析提供一种新的方法。本研究利用近红外光漫反射光谱技术对黄芩总黄酮及黄芩苷在近红外区域的特征吸收进行了研究，得到了它们在近红外特征吸收的波段范围，并在此基础上采用偏最小二乘算法(PLS)，建立了校正模型，对黄芩中的黄芩苷和总黄酮进行了定量分析。 1 实验部分 1．1 仪器与试剂 Bruker MPA FT-NIR光谱仪(德国布鲁克公司)，PbS检测器，设备配套的积分球漫反射采样系统和小样品杯，随机附带OPUS光谱采集和处理软件。Waters系列高效液相色谱仪(美国Waters公司)，包括Waters 600 controller， W aters 600 pump，W aters 2487 dual absorbance detector， Waters Empower工作站。LichroART C18柱(4．6 InlTl× 250 inrn，5 m)，电子分析天平(上海天平仪器厂)， KQ5200B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。752 型紫外一分光光度计(上海光谱仪器有限公司)。色谱甲醇(Fisher公司)，Wahaha纯净水(市售)，提取用甲醇为分析纯(北京化工厂)，其余试剂均为分析纯。对照品黄芩苷购于中国药品生物制品检定所(编号：110715— 200514)。 1．2 样品及制备黄芩样本共61个，于2004年至2006年间，采集于主产地山东、山西、河北及北京等地，并经中国医学科学院药用植物研究所生药专家林寿全鉴定为唇形科植物黄芩Scutel一laria baicalensis Georgi的干燥根。样本收集后，用毛刷刷去表面灰土并密封避光保存，实验时将其粉碎后过6o目筛，置 6O℃烘箱内烘l2～14 h，以除去水分，冷却后置干燥器中。 1．2．1 NIR光谱获取采用积分球漫反射采集系统，PbS检测器，扫描范围 12 000~4 000 cm一，扫描次数64次，分辨率8 cm～，以内置背景为参照。每批样品取3份重复3次，取平均值，57个校正集黄芩样品粉末的近红外漫反射光谱图见图1。 1．2．2 黄芩苷含量测定样品制备：称取黄芩粉末0．1 g，精密称定，加入5O％甲醇，30℃超声提取30 rain，冷却，定容至100 mL，0．45 m 微孔滤膜过滤，HPLC测定，进样量20 L，外标法定量。色谱条件为检测波长275 nm，流动相，A；甲醇：水：磷酸 (10：90：0．5 )，B；甲醇：水：磷酸(90：10：0．5 )， A，B梯度洗脱，流速为1 mL·rain 。 1．2．3 总黄酮含量测定样品制备：称取黄芩粉末0．1 g，精密称定，加入5O％甲醇，3O℃超声提取30 rain，冷却静置，微量取样器取0．1 mL 定容至5 mI 。测定条件：以黄芩苷作为对照品，在275 nrn处测定。 2 结果与讨论 2．1 光谱波段的筛选近红外光可在玻璃或石英介质中穿透而不被吸收，本实验直接将样品装于配套的小样品杯中进行近红外光谱采集。从图1可见不同样本的近红外光谱十分接近，无法直接判定黄芩苷和总黄酮的含量与个别波长点的吸光度之间的相关性，不可能从某一个波长点来确定其含量，而必须在一定的区间内建立数学模型来确定近红外光谱和含量间的关系。图中12 000~8 000 cm 区间内曲线平滑，吸光度无明显变化， 8 000~4 000 cm 区间信息量丰富，能反映出样品的性质和组成与光谱问关联度较高，所以选择在此区间内进行建模研究，避免了采用全谱建模所需的大量计算工作，并降低了噪音的干扰。 2．2 光谱预处理方法的研究在8 000~4 000 cm一区间内，比较研究了近红外光谱仪自带OPUS软件中的不同的光谱预处理方法，包括减去一条直线、矢量归一化、最小最大归一化、一阶导数等。以PLS 法分别对黄芩苷和总黄酮建模，模型可用相关系数(r)和校正集标准偏差(SEC)来评价，其预测能力可通过预测集标准偏差(SEP)作为衡量指标，各种光谱预处理方法所得模型的 RMSECV和RMsEP见表1，经过软件多次建模筛选出最优化的模型，具体参数见表2，参数计算参见文献E1o]。一阶导数和最小最大归一化的数据预处理方法分别在黄芩苷和总黄酮的建模中能得到最高的相关系数和最低的校正集和预测集标准偏差。 2．3 预测样品的分析结果和评价采用上述最优化模型来预测样本，所得结果见表3。从分析结果来看总黄酮比黄芩苷预测结果好，总黄酮预测偏差一般在5 以下(仅1个样品5．07 )，预测回收率94．91 ～ 1O4．49 ，黄芩苷的预测值偏差一般在1O 以下，预测回收率在93．38 ～109．55 。校正集的参考值和计算值间的关系见图2和图3。 3 结论本研究表明近红外漫反射光谱法在8 000 4 000 cm 范围内，以偏最小二乘算法，分别采用一阶导数和最小最大归一化预处理方法可同时实现对黄芩中黄芩苷和总黄酮的含量的快速测定。近红外光谱为中药质量的快速评价提供一种新的技术，它是一种间接测定含量的方法，其准确性受多种因素影响，如化学参考值的准确性、建模样品的多少和代表性、仪器因素及人为因素等。但我们相信如果采集足够的具有代表性的样品，严格控制实验条件，采用经典方法准确测定化学值，经过多种化学计量学方法处理，不断优化和完善校正模型，一定会得到满意的结果。该方法特别适合大量样品快速测定。