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| 滇黄芩毛状根的诱导及其黄芩苷含量测定 |
滇黄芩(Scutellaria amoena C．H．Wright)为唇形
科黄芩属多年生草本植物，是西南地区药用黄芩的
主流品种，现收载于《云南省药品标准》f李娅琼等，
2005)。滇黄芩的黄芩苷及黄芩素含量均高于黄芩，
是正品黄芩的高质量替代品，具有较大的开发潜力
(符洪等，2003)。
毛状根是发根农杆菌(A grobacteriz“m rhizogenes)
Ri质粒诱发的结果，为单细胞起源，具有生长迅速，
在无激素培养基上能够自主、持续生长，次生代谢产
物含量高且遗传稳定的特性，在植物基因工程育种
和生产实践中具有重要价值(王关林和方宏筠，1998，
科学出版社，PP．552—556)。利用发根农杆菌进行毛状
根诱导，在黄芩(Nishikawa et a1．，1 999；齐香君等，2006；
Tiwari et a1．，2008)和粘毛黄芩(王淑芳等，2008)上已
有报道，但对质量好、药用价值高的地方中药材品
种—— 滇黄芩的遗传转化未见报道。本实验室已通
过器官发生途径获得滇黄芩的组织培养再生植株，
并分析其遗传稳定性f岑举人等，2009)。在此基础上，
本实验利用发根农杆菌1．2556感染前期获得的滇黄
芩再生苗的茎和叶，诱导毛状根的产生，建立了滇黄
芩毛状根的离体培养体系并测定了毛状根中黄芩苷
含量，为滇黄芩毛状根大规模培养和黄芩苷次生代
谢产物的开发利用奠定基础。
1结果与分析
1．1毛状根的诱导
发根农杆菌感染后的叶片和茎段外植体接种于
含有300 mg／L头孢噻肟钠(Cefotaxime sodium，Cef)
的MS培养基上培养10～15 d后，有的外植体开始膨
大，在伤口处陆续长出白色的毛状根，茎段和叶片都
有毛状根的产生(图1A；图1B)，出根部位多在外植
体的形态学下端。未转化外植体在MS培养基上培
养一段时间后，也可能萌发出极细小的根，但在继代
培养过程中因不能自主生长而褐化致死。
毛状根在含头孢霉素的固体培养基上除菌完
全后，移到液体MS培养基中培养。毛状根生长速
度明显快于固体培养，细嫩的次级毛状根不断生成
f图1C)；30 d长成大量形态粗壮，无侧毛的次级毛状
根r图1D)。这些根在不添加激素的MS培养基中自
主生长，表现出典型的发根特征。
侵染3周后统计茎段和叶片外植体转化率(图2)。
不添加乙酰丁香酮(Acetosyringone，As)时，茎段的毛
状根转化率是1 1．1 1％，明显高于叶片3．33％的转化
率，为其3．34倍。而添加不同浓度的As时，结果发
现，20 i~mol／L As处理能明显提高叶片和茎段两种
外植体的转化率，其中叶片转化率是9．63％，达到未
经As处理的叶片转化率的2．67倍。进一步提高As
浓度，无论茎、叶转化率都逐步降低。
1．2毛状根rolB基因的PCR检测
rolB基因是发根农杆菌Ri质粒上与毛状根形成密切相关的基因(Di et a1．，1996)。以roIB基因的扩
增引物分别对滇黄芩对照根、获得的假定转基因毛
状根基因组DNA及发根农杆菌质粒DNA进行
PCR扩增f图3)，从农杆菌菌株、转化毛状根基因组
DNA中扩增出预期大小约为700 bp目的片段。而阴
性对照未转化植物根DNA未扩增出此条带。这表明
T—DNA上的rolB基因已整合入滇黄芩基因组DNA
中，被检测的单克隆是真正的毛状根。
1．3毛状根冠瘿碱检测
发根农杆菌Ri质粒TR—DNA中含有冠瘿碱合
成酶基因，该基因只在真核生物中表达，因此冠瘿碱
的存在常被作为检测农杆菌质粒转化表达与否的分
子标$~(Stanton，2003)。利用高压纸电泳技术检测毛
状根冠瘿碱，结果表明，所有毛状根均出现了甘露碱
的显样点，而阴性对照未转化植株的根未出现此显
样点(图4)。由此证明发根农杆菌的冠瘿碱合成酶基因已整合入滇黄芩转化组织基因组DNA中，并在转
化细胞中特异的合成冠瘿碱表达产物。
1．4毛状根黄芩苷的含量测定
对不同毛状根系提取物进行色谱分析发现，所
有的毛状根样品均含有黄芩苷，保留时间为25．7 min
与所购对照品相符(图5)。
含量分析中，标准品黄芩苷计算的回归方程和
相关系数分别为Y=60 355X一12 822，r=0．999 2。选取的6个转化毛状根系克隆经液体培养30 d后，测定
的黄芩苷含量不同，分别为2．09％，0．98％，0．87％，
1．68％，2．59％和2．36％。其中毛状根中黄芩苷含量最
高为2．59％，与野生药材黄芩中13．16％(刘美兰等，
2002)的黄芩苷含量相比，仅为药材黄芩的0．20倍。
但从3年单位时间黄芩苷生成量计算，毛状根系是
药材黄芩的7．18倍，可见毛状根培养技术是获得黄
芩苷的高效策略。
1．5毛状根再生苗的获得
切取毛状根系2～3 cm长的根尖置于添加6-BA
2 mg／L和NAA 0．2 mg／L的MS固体培养基上诱导不定芽，10 d后部分毛状根明显变粗，开始膨大、转
绿，25 d左右形成芽点，继而长成不定芽(图6A)。而
根尖培养于附加相同激素的MS液体培养基中，16 d
左右开始形成芽点，长出小不定芽(图6B)，继续培养
10 d，不定芽伸长，且毛状根快速生长并分枝，不断有
新不定芽产生(图6C)。生长状态良好的毛状根再生
不定芽可以在不附加任何激素的MS培养基上诱导
生根(图6D)。转化再生苗在形态上与未经感染的再
生苗无明显区别。同时，获得的毛状根根系中，有些在
无激素培养基上也会有绿色芽点出现，光照下培养，
能自主分化出芽，但分化率低。
2讨论
药用植物毛状根培养已在160多种植物获得成
功(杜雯等，2005)。本文利用野生型发根农杆菌感染
滇黄芩再生植株叶片和茎段，诱导产生了毛状根。滇
黄芩毛状根在无激素液体培养基中呈现出正常离体
器官的生长模式，具有快速生长特性，表现出典型的
毛状根特征。
实验中外植体类型和菌液处理都影响着转化效
率。滇黄芩茎和叶作为外植体都可以诱导产生毛状
根，但茎的转化率比叶的转化率高，这可能与滇黄芩
茎的分裂能力比叶片的分裂能力强，而生长旺盛的
组织对农杆菌更敏感有关(岑举人等，2009；许铁峰等，2000)，同属黄芩的发根诱导过程中同样表现出茎
段的转化效率高的特点(齐香君等，2006)。乙酰丁香酮
在多种双子叶植物中促进T．DNA转移(Katia et aL。
1 993)，实验表明20 p~mol／L As能够促进发根农杆菌
对滇黄芩外植体的转化，但过量的As对外植体造成
毒害作用，降低了转化率，因此As对滇黄芩的转化
有其适宜的浓度范围。
滇黄芩毛状根经HPLC检测黄芩苷的结果可
知，毛状根和原植物一样能产生次生代谢产物黄芩
苷。由于T．DNA插入植物基因组的位置、长度和拷
贝数千差万别，会导致不同的毛状根系合成次生代
谢产物能力不同(Lee et a1．，2004)，检测的6个毛根
克隆中黄芩苷含量最高2．59％，是最低含量0．87％
的2．98倍，差别明显。毛状根中黄芩苷最高含量也仅
为药材黄芩的0．2O倍，产生的次生代谢产物量低于
原植物的含量，这一结果与同属黄芩毛状根(齐香君
等，2008)和粘毛黄芩毛状根中(王淑芳等，2008)黄芩
苷含量低于野生黄芩一致，也与其他种属植物遗传
转化，如怀地黄毛状根中梓醇的含量低于鲜地黄和
生地黄中梓醇含量的报道相符(Zhou et a1．，2009)。同
时，我们注意到滇黄芩毛状根中黄芩苷含量比黄芩毛
状根(40 d)中8．16％的含量和粘毛黄芩毛状根(32 d)
3．58％的含量低，而文献报道滇黄芩中黄芩苷含量最
高(符洪等，2003)，分析认为可能T．DNA插入位置不
理想，未能获得高表达量的毛状根系，也可能次生代
谢物质在植物中是一个积累的过程，不同时间、培养
条件取材导致了测定含量不同。
滇黄芩药用部位为根茎，本研究建立的毛状根
培养体系，对滇黄芩转基因技术的完善和利用毛状
根生产黄芩苷的生物转化提供了实验基础。改变一
些外在的条件可以使预期的化合物产量提高f田恬
等，2009)，这些技术将对提高滇黄芩毛状根中黄芩苷
的含量提供有益的借鉴。
3材料与方法
3．1供试材料
滇黄芩(Scutellaria amoena C．H．Wright)的组织
培养无菌苗由本实验室培养获得。发根农杆菌A—
grobacterizMm rhizogenes 1．2556本实验室保存。
3．2发根农杆菌的活化
挑取发根农杆菌1．2556单菌落于YEB培养基
中，28℃下180 r／min振荡培养过夜。转接到新鲜培
养基培养至OD值为0．5时，分别加入终浓度为0、20 ixmol／L、50~mol／L和100 ixmol／L的乙酰丁香酮
(As)，继续振荡培养2 h后用于感染滇黄芩外植体。
3．3发根农杆菌转化
滇黄芩再生苗茎段和叶片切成小块，投入发根
农杆菌1．2556菌液，侵染10 rain，MS培养基上暗处
共培养2 d，而后转入含有300 mg／L Cef的MS培养
基除菌生长。3周后观察生根情况并统计转化率。转
化率(％)：生根外植体的总数／接种的外植体总数。
上述各试验每处理接种6瓶，每瓶接15块外植体。
3．4滇黄芩毛状根的培养
切下侵染部位长出的毛状根，单条毛状根分别
接种于含有300mgmCef的MS培养基上，每7～10d
转接1次，逐步降低抗生素浓度，经3-5次继代培养
后获得除菌的毛根系。切取除菌完全、生长快速的，毛
根系接种在不含激素的MS固体或液体培养基中培
养和增殖。
3．5毛状根的PCR检测
用CTAB法提取毛状根的总DNA，以非转化植
株毛状根总DNA作为对照(顾红雅和瞿礼嘉，1998)。
由大连TaKaRa公司合成r0 基因的PCR引物，上
游引物：5 CGC从GCTACAACATCATAG～3’，下游
引物：5'-CAGTAGATCTCACTCCAGCA一3’。PCR反
应体系20 L，其中DNA模板1 Ixg，上下游引物各
1 L(终浓度20 pmol／L)。PCR反应程序为：94~C预
变性4 min；94℃变性50 S；52℃退火50 S；72℃ ，延
伸1 min；循环5次；94~C变性50 S；50℃退火50 S；
72℃延伸I min；30次循环；72℃，延伸10min。预期
产物大小为700 bp。
3．6甘露碱检测
冠瘿碱检测参考王关林和方宏筠的方法f王关林
和方宏筠，1998，科学出版社，PP，552—556)。不同转化
毛状根克隆各称取0．5 g提取冠瘿碱，点样于层析滤
纸上。以非转化植株根为阴性对照，甘露碱标准品
(1．00 mg／L)为阳性对照，450 V进行纸电泳。扫描并
记录电泳结果。
3．7测定毛状根黄芩苷含量的条件及方法
采用Waters2695—2996型高效液相色谱仪(美国
Waters公司 测定不同转化毛状根克隆黄芩苷含量；
高效液相色谱柱Ultimate XB．C 1 8(4．6x250 mrn,5 m)；
流动相100 mmol／L甲醇：0．2％磷酸水(40：60)，流速1．0 mL／min，柱温：常温；检测波长280 m ，灵敏度
2．O0 AUFS，进样量20 LLL；黄芩苷对照品购自中国药
品生物制品检定所(批号110715-200815)。
黄芩苷样品溶液的制备以及标准曲线的绘制来
确定毛状根黄芩苷的含量，具体方法蛀牙参照孔
祥鹤(2009)进行。
3．8毛状根再生苗的获得
毛状根系切成2～3 cm长，置于6-BA 2 mgm 和
NAA 0．2 mg／L的MS固体培养基上诱导不定芽，待
不定芽长至3-5 cm时，切下移至MS培养基上诱导
生根。培养条件为(25±1)℃，光照16 h／d，光照强度
30~40 mol·m-2~s-I。
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