白果内酯与银杏叶提取物中的黄酮类物质、胶 体物质的溶解性差别很小，通常混为一体，呈粘膏 状，分离纯化极为困难。前人 4 对此做了尝试，结 果不甚理想。为获得较纯产品和提高生产效率，本 文尝试采用配位色谱技术对其进行分离。

 配位色谱是在传统色谱分离介质或目标产物中 引入配位剂，利用配位结合的高选择性，定向与目标物质或杂质结合，增强色谱的分离效果。配位色谱 能较好地保持目标产物的生物活性，且分离工艺简 便、经济适用，对环境友好。

 1 材料和试剂

 白果内酯(图1)对照品购自Sigma公司。大孔 无定型硅胶(150—200目)，青岛海洋化工厂产品； 甲醇，乙醇，超纯水，石油醚(沸程：6O一9O c【=)，醋酸 乙酯等；盐酸，氢氧化钠，硼砂均为分析纯。

 白果内酯初提物(其中白果内酯含量约为 9％)。初提物中其 他成分主要是糖类、黄酮类化合物、胶体和银杏苦 内酯等。

 2 仪器和设备

 Waters 2690高效液相色谱仪(包括四元梯度 泵，柱恒温系统，996二极管阵列检测器，410示差折 光检测器，Millenium 32工作站)，Agilent 1 100系列 液一质联用系统(VWD型可变波长扫描紫外检测 器，电喷雾电离源，四极杆质谱仪)，Nicolet Magna 750傅立叶变换红外光谱仪，冷冻干燥机等。

 3 提取和纯化方法

 3．1 色谱分离前配位预处理在色谱柱分离前，对白果内酯初提物进行配位处理。将初提物用70％ 乙醇水溶解成溶液，加入计算量的配位剂(pH值和 用量由实验决定)，混合使溶液均匀，静置30 min 后，按照固体物质的质量1：1加入硅胶，60℃ 真空 减压浓缩至干，得上柱样品。

 白果内酯的最适pH：对照品配制浓度为0．5 g · L 的乙醇溶液，白果内酯提取物样品配制浓度为 1 g·L 的乙醇溶液，分别用0．1 mol·L 的盐酸 和氢氧化钠调节溶液至pH 3—9之间。HPLC测定 各个样品的回收率。

 配位剂的用量：配制硼砂的饱和水溶液，按照计 算量加入到提取物的溶液中。然后用0．1 tool·L 的盐酸调pH。

 3．2 色谱分离 对配位预处理样品10 g，用硅胶 300 g吸附色谱进行干法柱层析，石油醚(沸程：60 — 90 oC)一醋酸乙酯的混合溶液梯度洗脱。洗脱过 程中，醋酸乙酯的浓度以5％ 递增，每个梯度洗脱1 L，混合溶剂的比例在白果内酯流出后保持不变。分 段收集洗脱液200 mL，HPLC检测，合并含较纯白果 内酯的流份，浓缩干燥。按照相同条件对样品做空 白对比实验。

 3．3 配位剂在色谱分离过程中的稳定性实验取 “3．1”项相应量的配位剂水溶液直接与硅胶混合， 105 oC干燥1 h，五氧化二磷干燥器中冷却至室温， 装柱，对未做预处理的样品干法柱层析。洗脱条件 同“3．2”项。

 3．4 白果内酯的HPLC检测条件 7J 色谱柱：No— vapak C18(Waters，3．9 mm X 150 mm，5 m)；流动相：乙醇一水(35：65)，检测波长：210 nm；RI(灵敏 度：64)；流速：1．0 mL ·min～；柱温：30 oC。 3．5 质谱条件ESI离子源，干燥气温度：350 oC， 氮气流速：10 L·min～，雾化室压力：276 kPa，毛细 管电压：4000 V。数据采集参数：质量范围：50— 1200，裂解电压：150 V，四极杆温度：100 oC。正负 离子检出模式。

 4 实验结果与分析

 4．1 白果内酯的最适pH 实验结果表明，白果内酯 在pH 4．5—5．5之间比较稳定。考虑到内酯类成分 在碱性条件下开环，含量大大下降。同时较强的酸性 环境也对内酯环的稳定性不利，虽然白果内酯的含量 下降较熳。由于对照品与实际样品所处的环境并不 相同，所以又采用对照品做上述试验，所得结果类似， 最终选择配位剂的pH范围在5．0左右，见图2。

 4．2 配位剂的用量通过白果内酯的最适pH实 验，加入配位剂后用盐酸调节提取物溶液的pH至 5．0左右。10 g白果内酯提取物样品，白果内酯的 含量为9％ ，其余的主要成分为黄酮苷、黄酮苷元和 糖类物质等，黄酮苷元与硼原子的配位比约为1：1， 单糖类物质与硼原子的配位比约为2：1。将提取物中的非白果内酯类物质折合成黄酮苷元或单糖类物 质，其摩尔数约为0．03 mol或0．06 mol，这与图3中 的纯度峰值相对应。10 g白果内酯提取物所需的配 位剂约为0．01 mol·L 的Na2B407。

 4．3 配位色谱制备分离结果

 4．3．1 色谱过程直观分析经Na B 0 柱前配位 预处理样品与未经预处理样品的柱层析色带相比 较，杂质所形成的深褐色色带滞留在色谱柱的顶端， 下移缓慢，当白果内酯流出时杂质色带未发生明显 移动，滞后时间明显。这是因为提取物除白果内酯 外以糖类和黄酮类化合物物质居多，硼砂可以和具 邻二羟基的化合物配位结合、与糖类化合物的同侧 邻位二醇基配位反应，配位结合后极性变大，在硅胶 表面的吸附增强，配位结合杂质的分子体积增大，在 洗脱液中的溶解性降低，总体表现为下移迟缓。

 4．3．2 洗脱曲线分析色谱法分离白果内酯洗脱 体积一含量曲线中的横坐标为醋酸乙酯和石油醚混 合溶剂的洗脱体积，纵坐标为示差折光检测器测得 的峰面积。当醋酸乙酯和石油醚的比例为20％ 时 能够洗脱出白果内酯。由图4可见：(1)配位色谱 法和普通色谱法中白果内酯的出峰时间不同(参见 图4和表1)。(2)曲线峰值对应于流份的白果内酯含量，曲线的最高峰值从大到小顺序依次为0．01 mol·L 硼砂、0．005 mol·L 硼砂和普通柱。从 峰的形状来看：Na B O 的曲线有明显的峰值；普通 色谱法的曲线呈梯形，含量相对较低，无对应高纯度 产品的突出峰。(3)曲线下面积对应得率。3条曲 线的面积从大到／bJl~序依次为0．01 mol·L 硼砂、 0．005 md·L 硼砂和普通柱。最终产品的纯度和 得率以浓缩干燥后的样品与对照品对照得出。见图 5和表1。

 4．3．3 理论分析配位色谱中白果内酯出峰的位 置也稍有延后，原因在于其分子结构中的l0位、8 位羟基以及内酯键的羰基的配位作用。只是这种单 齿的配位作用比较微弱，表现在配位色谱分离中的 白果内酯的出峰稍稍落后于普通柱。

 4．4 配位剂在色谱分离过程中的稳定性 采用配 位剂水溶液直接与硅胶混合干燥后上样分离，其分离 效果与非配位普通色谱无明显差异。查其原因主要 是柱床受流动相冲击，配位剂不能保持均匀稳定，随 流动相流失较多。而让待分离样品与配位剂在柱色 谱分离前充分反应，再将配位处理样品干燥后铺于柱 顶进行色谱分离，则无配位剂流失之忧。

 4．5 白果内酯纯品的结构分析与鉴定 结晶纯化 得到的白色针晶，熔点约300℃ 。HPLC测定为一单峰，A：：“nm：209．7。IR 一kBr am～：3450(羟基)， 1812、1781、1749(y一内酯)。ESI／MS m／z：349．2 [M+Na] ，325．3[M—H]一，251．3[M—C(CH3)3 一H O]一。与文献值 及对照品比较，结果一致。 推断该化合物确为白果内酯。

 5 结论

 本文采用配位硅胶色谱法分离纯化白果内酯初 提物中活性成分—— 白果内酯，相对于普通色谱法， 配位色谱分离的产品纯度提高了7％以上，回收率 提高11％以上。实验证明配位色谱用于白果内酯的分离纯化可行。