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| 大黄酚对脑缺血再灌注小鼠记忆功能的保护作用 |
以往研究证明，大黄酚可显著抑制大鼠肝、脑组织过氧化
脂质的生成，具有抗衰老作用 。但大黄酚对脑缺血再灌注
(I／R)记忆功能的影响，尚未见报道。本实验旨在采用改进的
Himori法 暂时性阻断两侧颈总动脉制备小鼠脑I／R损伤模
型，研究大黄酚对脑I／R小鼠记忆功能的保护作用，探讨其对
脑I／R损伤后记忆功能的保护作用机制，为其应用于临床治疗
血管性痴呆疾病提供理论和实验依据。
1 材料与方法
1．1 动物昆明种小鼠，体重(28±2)g，均为雄性，由中国医
学科学院药物研究所动物实验中心提供[许可证号：SCXK(京)
2004-0001]。
1．2 主要药品、试剂和仪器 大黄酚(纯度≥98％ ，批号
110796-200412，中国药品生物制品检定所)，实验前用N，N一二
甲基甲酰胺溶解，聚山梨酯一80助溶，生理盐水稀释至所需浓
度，N，N一二甲基甲酰胺：聚山梨酯一80：生理盐水的比例为1：1：
8。谷光甘酞过氧化物酶(GSH—Px)活力测试盒，超氧化物歧化
酶(SOD)测试盒(南京建成生物工程研究所)；亚硝酸钠
(NaNO：)(天津市化学试剂一厂)。XCS-2小鼠穿梭程序自动
控制仪(中国医学科学院药物研究所)；753BI微机型紫外可见
分光光度计(上海光学仪器制造厂)；Forma一86c uLT冰柜(一
80~C，美国热电公司)；Sigma3K30高速冷冻离心机(德国Sigma
公司)。
1．3 方法
1．3．1 小鼠脑I／R模型的制备在Himori法 基础上进行改
进。3．5％水合氯醛(10 ml／kg，腹腔注射)麻醉小鼠后，仰卧位固
定，自胸骨柄到下颌骨间行5～8 mm正中纵向切口，分离两侧颈
总动脉，分离后用液体石蜡浸泡过的黑色手术线穿过左右二侧
颈总动脉，尽量恢复两侧颈总动脉到原位，在气管上方轻轻将黑
色手术线打一松的反手结，结的松紧以不压迫气管为宜。在每
侧颈总动脉上方的黑线上穿过一条用液体石蜡浸泡过的白色手术线，按Himofi法埋线后缝合切口。术后48 h将颈下部黑色手
术线拉紧，阻断两侧颈总动脉造成大脑缺血状态，5 min后轻拉
两侧白色手术线，使颈总动脉恢复血液再灌注。
1．3．2 动物分组及给药每项实验均取小鼠70只，手术后
48 h将小鼠随机分为5组，假手术组(进行手术，但不进行脑L／
R)、I／R模型组(模型组)、药物组(模型+大黄酚)；药物组分
高、中、低剂量组，于缺血前30 min分别腹腔注射大黄酚l0．0、
1．0、0．1 mg／kg，模型组于缺血前30 rain腹腔注射溶剂
10 ml／kg，假手术组腹腔注射溶剂10 ml／kg。
1．3．3 穿梭实验XCS-2小鼠穿梭程序自动控制仪，底部为
不锈钢栅，栅间距为0．5 cm，加非条件刺激时有电流通过，电击
动物足底。顶部配置有噪声发生器(铃声刺激)，用来产生条件
刺激。在安静环境中，每天8：00～l2：0o进行实验，室温(22±
2)℃。程序设置为：蜂鸣5 s，继之电刺激15 s，间隔15 s，而后
重复上述程序，如此循环20次。电脑将自动记录小鼠遭受电
击次数、电击时间及主动逃避时间等参数，以评价小鼠的学习
记忆能力。每次实验测试前先把小鼠放入穿梭箱中，让小鼠在
箱内自由活动5 min，以消除其探究反射。然后正式进行学习
穿梭训练，记录小鼠被电击次数、电击时间和主动逃避时间。
除假手术组外，其余各组于训练后使脑缺血5 rain，然后恢复血
流。24 h后测试记忆成绩。
1．3．4 小鼠全血、脑组织GSH—Px和血浆、脑组织SOD活力测
定除假手术组外，其余各组均于48 h后立即缺血5 min，然后
恢复血供后10 min，将小鼠的颈动脉切开取血，肝素抗凝，并快
速断头取其脑组织置于Forma一86c ULT冰柜内冷冻贮存。将抗
凝全血用三蒸水制成1％ 溶血液，并将脑组织制成10％脑匀
浆。以GSH—Px试剂盒测定小鼠全血及脑组织中GSH．Px活力。
以SOD试剂盒测定小鼠血浆中SOD活力和10％脑匀浆组织
SOD活力。
1．3．5 小鼠亚NaNO 中毒实验除假手术组外，其余各组均
于手术后48 h阻断血流5 rain，然后恢复血流。24 h后参照文
献方法 ，各组立即腹腔注射NaNO 240 mg／kg，并开始记录，
以5 s内不再张口呼吸为观察指标。
1．4 统计学方法数据以 ±s表示，应用SPSS11．5统计软
件进行方差分析和t检验。
2 结果
2．1 大黄酚对脑I／R小鼠学习记忆能力的影响表1结果可
见，与假手术组比较，模型组小鼠表现出明显的记忆功能障碍。
小鼠被电击次数明显增加，电击时间明显延长(P<0．01)，主动
逃避时间明显延长。脑缺血前给予大黄酚，与模型组相比，高、
中剂量组缺血后小鼠被电击次数明显减少，电击时问明显缩
短，主动逃避时间缩短(P<0．01，P<0．05)。说明其对模型组
所致记忆功能障碍有明显的保护作用。
2．2 大黄酚对脑I／R小鼠脑组织中GSH．Px和SOD活力的影响与假手术组比较，模型组小鼠脑内、全血、血浆中GSH．Px、
SO1)活力明显降低(P<0．叭)；而脑缺血前给予大黄酚可使小
鼠脑内GSH—Px、SOD活力明显提高(P<0．01，P<0．05)
(表2)。
2．3 大黄酚对脑I／R小鼠全血中GSH—Px活力和血浆中SOD
活力的影响与假手术组比较，模型组小鼠全血中GSH．Px活
力和血浆中SOD活力明显降低(P<0．01)；而脑缺血前给予大
黄酚可使小鼠全血中GSH—Px和血浆中SOD活力明显提高
(P<0．01)(表2)。
2．4 大黄酚对脑I／R小鼠NaNO：中毒后存活时间的影响与
假手术组比较[(14．5±0．8)min]，模型组小鼠存活时间明显
缩短((9．4±0．7)min](P<0．01)。与模型组相比，预先给予
大黄酚使脑模型小鼠由于亚硝酸钠中毒缺氧后存活时间明显
延长，高剂量(13．2±0．6)rain(P<0．01)，中剂量(10．1±
0．5)min(P<0．05)，但与低剂量(10．1 4-0．7)rain无显著差
异，说明脑I／R小鼠由于NaNO，中毒所致耐缺氧的能力减弱，
大黄酚能提高小鼠耐缺氧能力。
3 讨论
学习记忆障碍是血管性痴呆患者普遍的临床表现。本实
验显示，脑i／R损伤可引起小鼠记忆功能障碍，在穿梭实验中，
小鼠被电击次数明显增加，电击时间明显延长，主动逃避时间
明显延长。而脑缺血前预先给予大黄酚则有明显保护作用。
提示大黄酚可能有助于改善缺血性脑血管病的预后，降低血管
性痴呆的严重程度或减少其发生。
脑1／R损伤与自由基的生成、细胞内钙超载、兴奋性氨基
酸毒性、白细胞高度聚集和高能磷酸化合物的缺乏等有关，特
别是氧自由基损伤引发脂质发生过氧化反应是I／R脑损伤的
重要发病机制。脑是富含脂质的组织，比其他组织对自由基更
为敏感。脑缺血时，由于ATP减少，造成细胞膜泵功能失灵，
ca“进入细胞激活ca“依赖的蛋白水解酶，使黄嘌呤脱氢酶(XD)大量变为黄嘌呤氧化酶(XO)，同时ATP释放能量而分
解，使ADP、AMP含量升高，并依次分解产生大量次黄嘌呤。在
灌注时，大量的分子氧随血液进入缺血脑组织，XO在催化次黄
嘌呤转化为黄嘌呤和尿酸的同时，产生大量0 和H：0 ，而
H 0：在金属离子的参与下形成·OH，造成氧自由基(OFR)爆
发性增加E4 J。本研究结果显示，模型组小鼠脑组织中SOD和
GSH—Px活性显著降低，预先给予大黄酚可使SOD和GSH—Px活
性显著升高，表明大黄酚可提高机体抗氧化酶的活性，减轻氧
自由基对细胞的损伤。本课题组以往的研究表明，大黄酚对离
体大鼠肝和脑组织过氧化脂质有明显的抑制作用 ，进一步印
证大黄酚对脑I／R小鼠记忆功能的保护作用机制可能是减少
自由基对中枢神经系统损伤。
亚硝酸钠属强氧化剂，可致高铁血红蛋白血症，破坏血红
蛋白携氧能力，引起氧的运送障碍而导致组织器官缺氧，进而
窒息死亡。脑的活动主要依靠葡萄糖的有氧氧化提供能量，它
是一个对缺氧最敏感的器官，一旦脑缺血达到一定程度，再灌
流不仅不能使缺血区代谢和机能得以恢复反而加重脑水肿及
扩大脑梗死面积。本研究表明，模型组小鼠亚硝酸钠中毒后存
活时间明显缩短，而预先给予大黄酚则使小鼠中毒后存活时问
明显延长，证实大黄酚具有抗缺氧作用。有实验表明 ，大黄
酚剂量依赖地抑制苯肾上腺素诱导的豚鼠胸主动脉环血管收
缩反应，降低最大收缩力，显示非竞争性阻断作用；大黄酚也可抑制组胺诱导的血管收缩反应，使最大反应降低19．2％ ，且明
显抑制KC1诱导的血管收缩反应，最大收缩力降低18．8％。提
示大黄酚抗缺氧作用可能与扩张血管，增加血流量，提高血氧
水平有关，详细机制在以后的实验研究中将进一步阐明。
本研究证明，大黄酚对脑I／R小鼠的记忆功能有一定的保
护作用，为其应用于临床治疗血管性痴呆疾病提供实验依据。
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