1 实验部分

 1．1 仪器与试剂

 LK2005电化学工作站(天津市兰力科化学电子高科技有限公司)；KQ．500DE型数控超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司)；UV757CRT型紫外一可见分光光度计(上海精密科技仪器公司)；PB一20标准 型pH计(德国赛多利斯股份公司)；三电极系统：玻碳电极(GcE)为工作电极，饱和甘汞电极(sCE)为参 比电极，铂丝电极为对电极．

 大黄酚(ARS)(中国药品生物制品检定所)，5．0×10～mol／L，使用时再进行稀释；牛血清白蛋白 (BSA)(北京奥博星生物技术责任有限公司)，相对分子质量为65 000，1．0×10, mol／L，4 oC保存；Brit— ton．Robinson(B—R)系列缓冲液；高纯N2(99．99％)；所用试剂均为分析纯，水为石英亚沸二次蒸馏水．

 1．2 实验方法

 电极预处理：先用小号金相砂纸将玻碳电极磨光滑，再用0．05 的a—Al2o3悬糊液抛光成镜面，依 次用乙醇和水超声清洗，用氮气吹干备用．

 以pH=4．0 B．R缓冲液为支持电解质，加入适量的大黄酚与牛血清白蛋白，与未加BSA的大黄酚溶 液比较，用循环伏安法、示差脉冲伏安法和紫外光谱法对该体系进行研究和测定．进行电化学实验时须 向溶液中通入高纯N2除氧，测定过程中溶液上方保持N2气氛．

 2 结果与讨论

 2．1 缓冲溶液的选择

 分别在HAc—NaAe，K2HPO4一KH2PO4，B．R缓冲体系中进行测试，结果表明大黄酚在B．R缓冲体系中 峰形好，灵敏度高，实验选用pH=4．0的B．R溶液为测定底液．

 2．2 大黄酚的循环伏安行为

 在pH=4．0的B．R缓冲溶液中对含5．0 X 10I5 mol／L大黄 酚溶液在0．2 一1．0 V电位范围及扫速为100 mV／s条件下进 行循环伏安扫描(见图1)．大黄酚中有1个还原峰(一0．482 V) 和2个氧化峰(一0．266，一0．453 V)．有一对可逆性较好的氧化 还原峰( =一0．482 V，Vpa=一o．453 V，，pc：，pa一1．2)，说明它嚣 在玻碳电极上的反应是一个可逆的氧化还原反应，由△ =E 一 E =60／n，计算电极反应的电子转移数为2．

 随扫描速度的增大，大黄酚的氧化还原峰电流明显增大．相 应还原峰电流厶与扫速口呈良好的线性关系， =1．309 4：1- 0．054 7 ，r=0．999 1．随扫描速度的增大，大黄酚的还原峰电位 明显减小．相应还原峰电位E。与扫速logv呈良好的线性关， EP=一0．209 4—0．066 91ogv，r=0．999 6．表明体系有明显的吸附 性，吸附过程为该电极反应的控制步骤．

 多圈扫描后峰电流和峰电位稳定，由于大黄酚结构中含有两个羟基(1，8位)，当电位从低向高电位 扫描时，分子结构中的羟基氧化为羰基，电极表面上活性基团可以作为亲核试剂进攻苯环．因此说明大 黄酚不是以聚合的方式修饰在玻碳电极上，而是以键合的方式修饰在电极表面上，形成稳定的沉积膜．

 2．3 缓冲溶液pH值对反应体系的影响

 配制pH为2．0～8．0的一系列B．R缓冲液，扫描电位在0．2～一1．0 V范围内，测定大黄酚的循环 伏安曲线，结果表明大黄酚的峰电位与pH值呈线性关系，E。=一0．139 5—0．059 3pH，r=0．999 8．系说 明该电极过程有质子参与．并且由Nemst方程求得参与反应的质子数m 2．

 在pH值大于8时的循环伏安曲线发生较大的变化，此时体系溶液颜色由原来橙黄色变为粉红色， 可能是形成共轭体系的酚羟基和羰基．从循环伏安曲线发现还原峰的电位变负的程度较大，并且已不符 合原峰电位与pH值的线性关系，因为9，10．蒽醌还原为氢醌后，氢醌重排生成酮式异构体，在更负的电 位处时异构体才被还原．

 2．4 大黄酚与BSA作用的电化学研究

 2．4．1 大黄酚与BSA作用的循环伏安法

 在pH=4．0的B．R缓冲液中，在5．0×10 mol／L的大黄酚溶液中，当加入BSA的浓度为5．0 X 10 mol／L时，在电位扫描范围内未出现新峰，氧化还原峰电流均下降，而峰电位基本不变．且随着BSA 浓度的增加，峰电流的降低值随之增加．说明大黄酚和BSA结合形成没有电化学活性的超分子化合物， 使溶液中游离的大黄酚浓度下降，对应氧化还原峰电流下降，如图2所示．

 2．4．2 大黄酚与BSA作用差分脉冲伏安法

 差分脉冲伏安法(diferential pulse voltammetry，DPV)可提高灵敏度和选择性，我们采用DPV法研究大黄酚与BSA相互作用的电化学行为见图3，大黄酚在pH=4．0的B—R缓冲液中，产生一个灵敏的还原峰， 峰电位为一0．459 V．在溶液中加入一定量的BSA后还原峰电位几乎不变，而峰电流大大降低，峰电流的 降低值同加入的BSA量在一定范围内呈线性关系，其线性回归方程为：AI。=一780+506c，r=0．998 7 (△，。为大黄酚与大黄酚和BSA化合物电流的差值，单位mA；C为BSA的浓度，单位mol／L)．检出限为 3×10～ mol／L．对5×10 moL／L的BSA进行7次平行测定，RSD为3％ ，因而可望用于BSA的定量测 定．

 2．4．3 反应时间对体系的影响

 大黄酚和BSA结合反应的速率很快，相互作用8 min后峰电流基本稳定，并在3 h内保持稳定．

 2．4．4 参与电极反应的电子数、质子数和电极反应标准速率常数计算

 电极反应电子数可由式1—3求得，大黄酚的电极反应电子数为2．大黄酚与BSA相互作用后，应用 同样的方法计算大黄酚的电极反应过程电子转移数也为2．

 ，p=n2F2I"Av／4RT=nFQv／4RT， (1)

 Q=nEAT’， (2)

 S=Qv． (3)

 式中，Q为电量，．s为峰面积， 为扫描速度，I1为吸附量．

 固定大黄酚和BSA的浓度，改变B．R缓冲溶液的pH值，以相应pH值的大黄酚溶液作参比，考察溶 液酸度对加入BSA后大黄酚峰电流和峰电位的影响．结果表明pH值的大小对两者相互作用有较大的 影响，pH=4．0时二者峰电流有最大的差值，相互作用最强，因此实验选取pH=4．0的B—R缓冲溶液．在 不同pH值条件下，引入BSA后的循环伏安图有共同特点，即在扫描电位范围内均未出现新峰，峰电位 基本不变，而峰电流却有不同程度的降低．随着溶液pH值的增大，峰电位E负移，其线性回归方程为： E。=一0．142 1—0．061 5pH，r=0．998 5，由2．3方法计算得电极反应质子为2．

 由峰电位随扫描速度的变化，可得电极反应的电荷转移系数a和表面电极反应标准速率常数 也【 ．当n3E。>200 nlV时，

 分别将还原峰电位E 氧化峰电位E 对扫描速度的对数log 作图，可获得两条直线，由直线的斜率求得口值． 由(6)公式计算：

 文献[16]报道对于大多数反应体系，a值在0．3～0．7之间．本文计算得到的a值与文献相符．

 通过实验和计算发现大黄酚的电极反应过程电子转移数与质子数均没有变化．说明无论BSA是否 存在，大黄酚的电极反应没有变化，只是体系游离的大黄酚浓度降低，使峰电流降低．

 2．5 大黄酚与BSA相互作用的光谱研究

 2．5．1 大黄酚与BSA相互作用紫外光谱特征

 对pH=4．0的B—R缓冲溶液在200～500 nln进行紫外吸收光谱扫描，以去离子水为参比，扫描波长 范围内无明显吸收．取一定量的BSA溶于pH=4．0的缓冲溶液中使BSA的浓度为5．0 x 10～mol／L，在 200 500 nlTl进行紫外吸收光谱扫描，如4图(a)线，显示牛血清蛋白在278 nln处有一个吸收峰．

 取一定量的大黄酚溶液加到pH=4．0的B．R缓冲溶液中使大黄酚的浓度为1．0 X 10一mol／L，从 200 500 R1TI进行吸收光谱的扫描，如图4 )线．大黄酚的3个吸收峰分别是272，292和409 nrn；而牛血 清蛋白在278肿处有一个吸收峰，为了避免BSA的吸收的干扰，大黄酚的观察峰选在远离这些吸收峰 处，选择409 rlnl观察吸收光谱的变化．

 取一定量大黄酚和BSA溶解到pH=4．0的B—R缓冲溶液中，使大黄酚和BSA的浓度均为1．0× 10一mol／L，在室温下混合均匀，放置8 min时间以保证结合反应达到平衡．在200—500 rl／n进行吸收光 谱的扫描，如图4(c)线．发现加入BSA后吸收光谱图发生了变化．说明大黄酚与BSA发生了结合反应．‘

 2．5．2 大黄酚与BSA相互作用正交投影解析

 对大黄酚和BSA相互作用体系，可用大黄酚的光谱(s )和BSA光谱(Sb)构成一正交阵 ，在按设 定的反应时间后，获取反应体系的混合物光谱(5ab)，并对正交阵进行投影．应用Matlab6．5语言编制程 序进行计算，得到大黄酚与BSA相互作用的残余光谱矢量模值0．460 3，残余光谱曲线如图5所示．大黄酚与BSA相互作用所得的残余光谱为非零曲线，残余光谱矢量模的值大于零，说明该反应体系有新的 具有光谱特征的物质生成，即大黄酚与BSA发生了结合形成了新的超分子化合物．

 2．6 机理探讨

 由于BSA的空间结构由3个结构域组成，每个结构域由2个亚结构域以槽El相对的方式形成圆筒 状结构，几乎所有疏水性氨基酸残基都包埋在圆筒的内部，构成疏水性腔．研究表明，对大黄酚体系中是 否加入BSA对其电化学参数无显著的影响．因此进一步推测大黄酚与BSA作用后形成了一种非电活性 的超分子化合物，大黄酚进入BSA圆筒内部，BSA分子中的疏水性氨基酸残基进入大黄酚的蒽环结构， 由于BSA的包埋使得大黄酚的电化学活性基团隐藏于BSA内部而不易在电极上发生氧化还原反应，导 致大黄酚的氧化还原峰电流降低．

 3 结论

 大黄酚与BSA相互作用前后电极反应过程电子转移数、质子数和表面电极反应标准速率常数等电 化学参数均未发生显著变化．并且发现作用前后循环伏安曲线的形状基本不变，只是相应的峰电流有所 下降．表明大黄酚与BSA相互作用形成非电化学活性的超分子化合物，使氧化还原反应的峰电流下降． 大黄酚修饰电极可作为蛋白质的电化学探针用于蛋白质的测定．

 根据正交投影方法原理，应用Matlab6．5语言编制程序对大黄酚与BSA相互作用进行了计算，进一 步证明了大黄酚与BSA相互作用形成一种超分子化合物结论的正确性．