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| 大黄素对模拟冷缺血再灌注后肝细胞内钙离子浓度及细胞凋亡的影响 |
大黄素El-z]化学结构为1，3，8一羟基一6一甲基蒽醌，具有抗炎、抗肿瘤、保护肝肾等多种生物学作用。有
文献报道 。 ，大黄素可对细胞内钙离子浓度及细胞
凋亡产生影响。钙超载及凋亡均为缺血再灌注损伤
机制之一。本课题组前期研究发现嘲，大黄素对肝细胞体外模拟冷缺血再灌注损伤具有保护作用。该保
护作用是否与抑制肝细胞内钙超载及凋亡有关?大黄
素对冷缺血再灌注后肝细胞内钙离子浓度及凋亡的影
响未见相关报道。本研究拟通过观察大黄素对模拟冷
缺血再灌注后肝细胞内钙离子浓度及凋亡的影响，初
步探讨其对冷缺血再灌注损伤可能的保护机制，为其
在临床肝移植中的应用提供一定的实验依据。
1 材料与方法
1．1 材料肝细胞株HL-7702由中国科学院上海生
命科学研究院细胞库提供；RPMI 1640培养基为美国
Gibeo公司产品；胎牛血清由杭州四季青生物工程研究
所提供；混合气体95 N2—4 CO2—1 O2由西安交
通大学医学院后勤中心提供；大黄素、AnnexinV凋亡
试剂盒为美国SIGMA公司产品。AO／EB凋亡检测试
剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。Fluo-3／
AM 钙离子荧光探针为美国Biotium公司产品；LDH
检测试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。流式细
胞仪型号FACSCabuliburT USA，Olympus荧光显微镜
型号BX51TR-32FB3一E01 Japan。
1．2 冷缺血再灌注损伤模型的建立及实验分组模
拟冷缺血再灌注模型参照文献E6]的方法并加以改
进：① 肝细胞HL一7702体外培养至对数生长期，等量
均匀接种于6孑L板或25 mL培养瓶中，给予大黄素
干预，按100、10、1 mol／L分为高、中、低浓度组和对
照组(未予大黄素干预)，培养24 h准备实验；② 模拟
缺血：将培养液吸弃，等体积加人模拟缺血溶液
(NaCl 98．5 mmol／L、KCl 10 mmol／L、NaH2PO4 0．9
NaH2 PO4 0．9 mmol／L、NaHCO3 20 mmol／L、CaC12
1．8 mmol／L、MgS04 1．2 mmol／L、葡萄糖55 mmol／L、
HEPES 20 mmol／L，pH 7．4，37℃)，并给予大黄素
干预，放入50 mL／L CO2孵箱中37℃ 培养6 h。
1．3 细胞内钙离子浓度、细胞凋亡水平及上清液乳
酸脱氢酶的检测 Fluo一3／AM 钙离子荧光探针负载
细胞悬液，终浓度10 Fmol／L，37℃避光孵育30 rain，
PBS洗涤两遍重悬，流式细胞仪检测分析，平均荧光
强度代表细胞内钙离子浓度。Annexin V—PI双染法
检测细胞凋亡率(apoptosis rate)及正常细胞比例
(normal cell rate)。AO／EB染色法荧光显微镜下观
察细胞凋亡情况，严格按照试剂盒说明书操作，绿色
荧光代表正常细胞，橘红色荧光代表凋亡细胞。上清
液乳酸脱氢酶(1actate dehydrogenase，LDH)含量的
检测严格按照试剂盒说明书操作。
1．4 统计学处理采用SPSS 13．0软件进行统计分
析。数据用 士 表示。统计方法采用单因素方差分
析，多重比较用LSD-t检验。P(0．05为差异具有统
计学意义。
2 结 果
2．1 冷缺血再灌注后细胞内钙离子浓度、细胞凋亡
水平及上清液LDH 的含量 流式细胞技术检测结
果中平均荧光强度(mean fluorescence intensity，
MFI)代表细胞内钙离子浓度，模拟冷缺血再灌注后，
各浓度大黄素处理组细胞内钙离子浓度均显著低于
对照组，差异具有统计学意义(P<0．01)。并且随大
黄素浓度增加，钙离子浓度有降低趋势，各浓度大黄
mmol／L、NaHCO。6．0 mmol／L、CaCI l_8 mmol／L、 素处理组之间差异具有统计学意义(P<0．05)。各
MgSO 1．2 mmol／L、乳酸钠40 mmol／L、HEPES 20 浓度大黄素处理组细胞凋亡率显著低于对照组，正常
mmol／L，pH 6．8，4℃)，并给予大黄素干预。再将培 细胞比例显著高于对照组，差异具有统计学意义
养容器放人缺氧培养装置中，充入混合气体(95 (PO．05)，但高浓度组与中、低浓度组之
气口与出气口，放人4℃ 冰箱保存8 h；③ 模拟再灌 间差异具有统计学意义(P大黄素
干预，放入50 mL／L CO2孵箱中37℃ 培养6 h。
1．3 细胞内钙离子浓度、细胞凋亡水平及上清液乳
酸脱氢酶的检测 Fluo一3／AM 钙离子荧光探针负载
细胞悬液，终浓度10 Fmol／L，37℃避光孵育30 rain，
PBS洗涤两遍重悬，流式细胞仪检测分析，平均荧光
强度代表细胞内钙离子浓度。Annexin V—PI双染法
检测细胞凋亡率(apoptosis rate)及正常细胞比例
(normal cell rate)。AO／EB染色法荧光显微镜下观
察细胞凋亡情况，严格按照试剂盒说明书操作，绿色
荧光代表正常细胞，橘红色荧光代表凋亡细胞。上清
液乳酸脱氢酶(1actate dehydrogenase，LDH)含量的
检测严格按照试剂盒说明书操作。
1．4 统计学处理采用SPSS 13．0软件进行统计分
析。数据用 士 表示。统计方法采用单因素方差分
析，多重比较用LSD-t检验。P(0．05为差异具有统
计学意义。
2 结 果
2．1 冷缺血再灌注后细胞内钙离子浓度、细胞凋亡
水平及上清液LDH 的含量 流式细胞技术检测结
果中平均荧光强度(mean fluorescence intensity，
MFI)代表细胞内钙离子浓度，模拟冷缺血再灌注后，
各浓度大黄素处理组细胞内钙离子浓度均显著低于
对照组，差异具有统计学意义(P<0．01)。并且随大
黄素浓度增加，钙离子浓度有降低趋势，各浓度大黄素处理组之间差异具有统计学意义(P<0．05)。各浓度大黄素处理组细胞凋亡率显著低于对照组，正常细胞比例显著高于对照组，差异具有统计学意义细胞比例显著高于对照组，差异具有统计学意义(PO．05)，但高浓度组与中、低浓度组之间差异具有统计学意义(P大黄素处理组培养上清液中LDH水平显著低于对照组，差异具有统计学意义(P
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