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| 大黄素温敏凝胶对人牙周膜细胞的毒性作用 |
牙周病是口腔常见病之--，是仅次于龋病导致牙列
缺损的第二大原因，目前国内外均无理想的治疗方法。
牙周病治疗的最终目标是使退缩的牙周组织再生，其中
牙周膜细胞起着至关重要的作用。本研究自制大黄素壳
聚糖温敏凝胶，采用体外细胞培养技术和四甲基偶氮唑
盐(MTT)比色法研究大黄素温敏凝胶对人牙周膜成纤维
细胞的生物学作用，为其在临床上的开发应用提供一定
的理论依据。
1 材料与方法
1．1 主要试剂与仪器壳聚糖、B一甘油磷酸钠(美国西
格玛公司)，大黄素标准品(中国药品生物制品检定所)，
DMEM细胞培养基、胎牛血清和胰蛋白酶[含有乙二胺四
乙酸(EDTA)，北京海克隆生物化学制品有限公司]；四甲
基偶氮唑盐(MTT，美国西格玛公司)；二甲基亚砜(DM—
s0，分析纯，北京化工厂)。标准型细胞培养板(美国Corning
公司)；二氧化碳细胞培养箱(型号：BBGP系列，上
海仕博生物技术有限公司北京分公司)；倒置相差显微镜
CK型(日本Olympus公司)；高速低温离心机(型号：1—
15K，美国西格玛公司)；超净工作台(型号：YJ90o，苏州工
业园区三兴净化科技有限公司)；酶标仪(型号：550，美国
伯乐生命医学产品有限公司)。
1．2 大黄素壳聚糖温敏凝胶制备参照文献[1，2]，将
壳聚糖200 mg溶于10 mL0．1 mol／L盐酸溶液中，充分搅拌，即成2％壳聚糖水溶液，高压蒸汽灭菌消毒，将B一甘
油磷酸钠粉末800 mg溶解于10 mL氢氧化钠(NaOH)稀
溶液(约0．03 mo]／L)中，0．22 m滤膜过滤除菌，将
100 mg大黄素加入到B一甘油磷酸钠溶液中，将消毒过的
2种溶液冰浴15 min，将大黄素B一甘油磷酸钠溶液逐滴
加入到壳聚糖溶液中，至溶液pH值为7．1，并持续搅拌
10 min，4℃下保存，备用。使用时将溶液注入适当的模具
中，放置到37℃孵箱中10—15 min即可凝结为固态的含
有0．5％大黄素的壳聚糖温敏凝胶。
1．3 细胞培养取临床因正畸需要拔除的无龋病、无牙
周病、无根尖周病的健康前磨牙，拔牙后立即放人含有双
抗的DMEM培养液中，在超净工作台内，用培养液反复清
洗3次后，刮取根中2／3的牙周膜组织，用牙科探针将其
均匀分布在25 mL培养瓶底，倒置培养瓶，加入3 mL含
100 mg／L胎牛血清、100 mg／L青霉素及100 mg／L链霉素
的DMEM培养液，置于CO：培养箱，于37％ ，体积分数
5％ CO，条件下培养4 h，待组织块贴壁后，缓慢翻转培养
瓶，继续培养。每3 d换液1次，待细胞达到汇合点时，用
2．5 g／L的胰酶消化，按1：2传代。原代培养的人牙周韧
带细胞(PDLCs)传至第3代，免疫组化染色鉴定细胞的组
织来源。
1．4 浸提液制备按0．02 g／mL的标准，将20 mg大黄
素温敏凝胶材料分别加入不同体积的含100 mI／L胎牛
血清的DMEM培养液中，37℃ 下保持24 h。制备出50
倍、10倍、2倍、0．2倍的标准浓度的4种大黄素温敏凝胶
浸提液。阳性对照组用纯铅材料，按0．02 g／mL加入培养
液制备浸提液。
1．5 细胞毒性试验 消化第3代细胞，离心后用含
100 mL／L胎牛血清的DMEM培养液吹打成单细胞悬液，
用细胞计数板调整细胞浓度至2×10 ／mL，接种于96孔
板，每孔加入0．1 mL。培养24 h，镜下观察大多数PDLCs
贴壁并伸展，加入浸提液0．1 mL／孔，使孑L内最终浓度分别达到25倍、5倍、1倍、0．1倍标准浓度，每种浓度的浸
提液加6孔，空白对照组加入0．1 mL培养液，将96孔板
置37℃ 、体积分数5％CO 条件下培养，分别于24、48、72、
96 hR出1块培养板，于每孔中加入5 g／L的MTT 20
继续培养4 h，吸去孔内培养液，每孔加入150 DMSO，
振荡10 rain，用酶标仪于490 nITl波长下测吸光度(A)
值：并计算细胞相对增殖率(Relative Growth Rate，RGR)。
公式：RGR =实验组A值／阴性对照组A值×100％ 。根
据RGR值，按表1评分标准评定材料毒性程度级别 。
1．6 统计学方法采用SPSS 16．0统计软件包进行统计
学处理，结果以均数±标准差( ±s)表示，组间比较采
用方差分析和q检验。
2 结果
2．1 细胞的培养和形态学观察 牙周膜组织原代细胞
在第8 d从组织块中游出，以组织块为中心呈放射状排列
生长。倒置显微镜下观察细胞呈长梭形，胞体丰满，胞浆
均匀，核圆，核仁清晰。传代后细胞生长旺盛，状态良好。
免疫组化染色表明，细胞胞浆波形丝蛋白阳性，角蛋白阴
性，证明所培养的细胞为来自中胚层的成纤维细胞，可用
于后续实验。
2．2 各组Mr丌实验结果
2．2．1 各组不同时间点MTr吸光度(A值)比较 见
表2
由表2可见，在培养初期24 h，各浓度组与对照组比
较、各浓度组比较吸光度(A)值差异均无统计学意义
(P>0．05)；培养48 h后，各浓度组吸光度(A)值均高于
对照组，差异有统计学意义，(P <0．05)，不同浓度的浸
提液各组之间：25倍组与0．1倍组、1倍组差异无统计学意义(P>0．05)，5倍组与1倍组、25倍组、0．1倍组比较
差异均有统计学意义，5倍组吸光度(A)值高于25倍组、1
倍组、0．1倍组(P <0．05)。
2．2．2 各组细胞相对增殖度及毒性评级比较见表3。由表3可见，在24、48、72、96 h各个不同的时间点检
测，无论是高浓度的浸提液还是低浓度的浸提液，大黄素
壳聚糖水凝胶材料细胞毒性均为0级或1级，完全符合生
物材料的安全评价标准。
3 讨论
人牙周膜成纤维细胞是牙周韧带组织中的主要细胞，
它参与调节牙周韧带组织的新陈代谢，形成胶原纤维、合
成细胞外基质，与牙周病的发病和修复过程有密切关系。
因此，如何增强残存人牙周膜成纤维细胞的增殖能力、提
高牙周组织的再生潜能是牙周病治疗的一个重要课题。
中药大黄具有广泛的生物学效应，目前倍受关注。大
黄蒽醌衍生物为大黄的主要成分。其中大黄素和大黄酸
的抗厌氧菌作用已得到证实 。有研究发现大黄蒽醌衍
生物可使体外培养的人PDLCs数量增加，对其生长具有
明显的促进作用，而不会影响细胞形态改变 。
壳聚糖温敏凝胶系统是一种使用方便、有望在多个领
域应用的优异的载药系统，近年来受到高度关注 ’ 。其
主要成分是天然高分子材料壳聚糖，室温条件下该系统呈
生理中性的溶液，当温度升高到37~C时，该系统可以迅速
发生相转变，成为半固态的水凝胶。Tarsi等 发现壳聚
糖在口腔黏膜的附着时间>4 d，存留时间明显长于聚乙
烯氧化物等生物附着性强的材料，认为壳聚糖是更理想的
口腔药物的载体。我们前期实验证实壳聚糖温敏凝胶对
人牙龈或纤维细胞无毒性作用 J，本研究在前期实验的基
础上，成功制备出大黄素温敏凝胶，以体外培养的人
PDLCs为模型，通过MTT实验评价其对人牙周膜成纤维
细胞的毒性作用。我们采用4种不同浓度浸提液测试，采
用6级毒性分级法，结果显示各浓度的大黄素壳聚糖水凝
胶材料对牙周膜细胞均无毒性作用，而且对牙周膜细胞的
增殖有明显的促进作用。
因为壳聚糖温敏凝胶具有保存条件下是溶液状态但
是植入体内可以原位凝固的特点，因此可以通过注射的方式将其放置于需要的部位。牙周组织缺损大多不规则，而
溶液状态的凝胶可以方便的充盈到缺损的各个角落，凝胶
固化后，提供空间维持以及缓释活性因子及药物的作用。
现有治疗牙周病抗菌药物多局限于抗生素类的化学制剂，
长期使用易产生耐药性或干扰口腔菌群生态平衡，因此开
发大黄总蒽醌等成分的局部制剂治疗牙周炎，将具有广阔
应用前景。
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