1 材料和方法

 1．1 材料细胞：NRK52E细胞购于北京协和医科大学。主 要试剂：大黄素标准品(纯度99％ ，Sigma)，用二甲亚砜(DM— SO)溶解新鲜配制，用DMEM／F12培养液调至实验所需的浓 度，使DMSO在培养液终浓度不超过1％ 。葡萄糖(Sigma)； 胎牛血清(中国杭州四季青公司)；DMEM／F12培养基和胰蛋 白酶(Gibco)；小鼠抗大鼠TSP1单抗(R&D)；兔抗大鼠TGF — B 多抗(Santacruz)；小鼠抗大鼠B—actin单抗(R&D)；二 步法荧光扩增试剂盒、荧光反转录试剂盒(大连宝生物)；人 TGF—p，免疫检测试剂盒(上海生工)；山羊抗小鼠、山羊抗 兔HRP标记抗体(KPL)。

 1．2 方法细胞培养、细胞活力检测和分组调细胞密度 为1 x 10。，加入含10％胎牛血清的DMEM／F12培养液，置于 37℃ ，5％CO 培养箱中培养，1d后换1％胎牛血清培养24小 时使细胞同步化。细胞活力检测使用台盼蓝排斥试验，本试 验活细胞率大于95％以上。并按以下方法随机分为5组：空 白对照组、高糖组(30mmol／L)、其它3组分为大黄素低浓度 干预组(10ug／ml大黄素加终浓度为30mmol／L高糖)、大黄素 中浓度干预组(20ug／ml大黄素加终浓度为30mmoL／L高糖) 和大黄素高浓度干预组(40ug／ml大黄素加终浓度为30mmol／ L高糖)。大黄素比高糖提前二小时加入。继续培养24h后 收集细胞进行各指标的检测。独立试验重复三次。

 Real Time PCR：RNA纯化提取和PCR扩增均按试剂盒 说明书进行。上述试验重复三次。引物序列见表1。

 Western—Blot：提取细胞总蛋白，测定蛋白浓度后各取样 本50ug上样，行SDS—PAGE电泳。半干转仪电转至PVDF 膜上。分别加入I抗(1：400稀释的TSP1及TGF一13，多抗) 及1：100130的13一actin单抗，4oC过夜。分别加入Ⅱ抗，(均 为1：3000稀释的山羊抗小鼠或山羊抗兔HRP标记抗体)，室 温1h。扫描图片，用Image J分析软件分析每个特异条带灰 度值。上述试验重复三次。

 ELISA检测：按照TGF—B 免疫检测试剂盒说明书分别 检测细胞上清液中活性和总的TGF—B 含量。上述试验重 复三次。

 统计学处理：应用SPSSIO．0统计软件对实验数据进行统 计学处理，采用t检验或单因素方差分析，并用SNK—q检验， 作各组间均数两两比较。P <20．05认为差异具有统计学意 义。

 2 结果

 2．1 高糖对NRK52E细胞TSP1、TGF—B 表达的影响Re al Time PCR结果显示，与空白对照组比较，高糖(30mmoL／L) 明显上调了NRK52E TSP1的mRNA表达(3．34-t-0．18 vs 1． 12±0．13；t TSP1=2．968 P <20．05)、伴有TGF—Bl的mR— NA表达增力Ⅱ(3．52±0．22 vs 1．24±0．09；t TGF—Bl=2． 876，P <20．05)。见图1。western blot结果显示，高糖 (30mmol／L)也上调了TSP1蛋白表达(0．5184-i-0．0736 v8 0． 1204±0．0376；t TSP1=3．836，P<2O．01)，伴有TGF一13．蛋 白表达的增加(0．5698±0．0324 vs 0．1032 4-0．0322；t TGF— p1=3．798，P<20．01)。见图2。

 2．2 大黄素对高糖刺激的NRK52E细胞TSP1、TGF—B，表 达的影响 与高糖(30mmol／L)阳性对照组比较，低浓度大黄素对NRK52E TSP1和TGF—B 的mRNA表达无明显影响 (q TSP1=2．64，q TGF—B】=2．87，P都>0．05)；中浓度大 黄素抑制了高糖诱导的NRK52E TSP1和TGF—B1的mRNA 表达(q TSP1=4．14，q TGF—B，=4．21，P都<0．05)；高浓 度大黄素显著抑制了高糖诱导的NRK52ETSP1和TGF—B。 mRNA表达(qTSPI=6．11，qTGF—Bl=6．25；P都<0．O1)。 见图1。同时，与高糖(30mmol／L)阳性对照组比较，低浓度大 黄素对NRK52E TSP1和TGF—B，的蛋白表达亦无明显影响 (q TSP1=2．14，q TGF—B】=2．21，P都>0．05)；中浓度大黄素抑制了高糖诱导的NRK52ETSP1和TGF—B1蛋白表达 (q TSP1=4．33，q TGF—B】=4．41，P都<0．05)；高浓度大 黄素显著抑制了高糖诱导的NRK52E TSP1和TGF—B。蛋白 表达(qTSP1=6．34，qTGF—Bl=6．76，P都<0．01)。图2。 2．3 与空白对照相比，在高糖诱导下，NRK52E细胞培养 上清液中总的和活性TGF—B。含量明显升高(t总=2．690，t 活=2．645，P<20．05)。与阳性对照组相比，低浓度大黄素 组总的TGF—p 含量、活性TGF—p。含量无明显变化(q总 = 1．08，q活=1．21，P >20．05)；中浓度大黄素组总的TGF — B，含量和活性TGF— 。含量均减少，(q总=4．16，q活= 4．32，P<20．05)；高浓度大黄素组总的TGF—B1含量和活 性TGF—B1含量均明显减少(q总=6．11，q活=6．36，P< 2O．01)。见图3。

 3 讨论

 糖尿病肾病(DN)是糖尿病的严重并发症之一，也是导致 尿毒症的重要病因。高血糖不仅可导致糖尿病患者肾小球、 肾小管的严重损伤，而且高血糖还可促进肾小管间质纤维化， 后者对于糖尿病肾病肾功能衰竭的进展无疑具有更重要的意 义 。研究表明，肾小管上皮细胞不仅是肾小管间质纤维 化的被动受害者，而且也是肾小管间质纤维化的主动参与 者。现有研究表明，肾小管上皮细胞可表达MCP一1、RANTES 、MIP一1、TGF一13 、结缔组织生长因子等参与肾脏的损伤 过程。研究发现TSPI和TGF—B 在肾小管间质纤维化的病 理过程中发挥着重要的作用。TSP1通过与TGF—B 前体相 关肽(LAP)的接触反应使TGF—B 一LAP非共价结合解离， 导致TGF—B。活化而发挥其病理作用 。TGF—p。作为参 与体内细胞生长、分化和免疫反应的重要介质，它的过度活化 与肾小管问质纤维化密切相关。因此，寻找药物抑制这些炎 症因子、生长因子等的释放就成为预防肾问质纤维化的关键。

 近年，大量动物试验和临床研究发现中药大黄具有良好 地延缓肾衰的作用。大黄的主要活性成分包括大黄素、大黄 酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素和土大黄素、番泻苷等，尤其大黄 素在肾脏疾病研究中颇受关注。为进一步揭示大黄素防治肾 间质纤维化的机制，本研究在体外细胞培养的基础上，模拟体 内高糖的致肾纤维化作用观察大黄素对高糖处理的NRK52E 细胞的TSP1和TGF—B，表达的影响，探讨大黄素防治糖尿 病肾病肾纤维化的作用机制。

 本研究发现，正常状态下，TSPI在小管上皮细胞适量表 达，高糖能明显增加NRK52E TSP、TGF—B。mRNA和蛋白表 达水平。ELISA结果也显示，高糖能明显上调NRK52E细胞 培养上清中总的和活性TGF一8，水平。我们既往的研究曾 表明，高糖刺激下，TSP1的表达峰时间早于TGF—B 的表达 峰时间。这提示TSP1可能在疾病早期发挥着重要的作用。 生理状态下TGF—B。以非活性前体复合物的形式存在，只有 当TGF—B由非活性状态向活性状态转变后，活性TGF—B 才能与其受体结合，进而激活TGF—B信号转导通路引发下 游效应。因而在特定的病理及生理条件下，在特异的器官组 织中，TGF一13。由非活性向活性形式的转化是决定TGF—B 活性水平的一个重要因素。" 本研究结果显示TSP1mRNA 和蛋白上调表达的同时伴有TGF—p。mRNA和蛋白表达增 加，高糖上调TGF—B 的表达可能与激活TSP1一TGF—B 途 径有关。

 大黄素干预试验表明，中、高浓度大黄素不仅能抑制高糖 诱导的NRK52E TSP1、TGF—B1 mRNA和蛋白表达，而且能降 低高糖诱导的NRK52E总的和活性TGF—p。的水平。对大 鼠肝脏纤维化模型、大鼠残余肾模型的研究发现，TSP1肽抑 制剂(GGWSHW肽)能使得活性TGF—B 的表达明显减少， 肝、肾组织基质蛋白的沉积减少，肝、肾纤维化程度得到改 善 ]。因此干预TSP1的产生可能是防治肾小管间质纤维 化病变的重要靶点。本研究提示大黄素一方面通过抑制上游 分子TSP1mRNA和蛋白表达，抑制TSP1一TGF一8 途径，继 而下调活性TGF—B。水平；另一方面也通过直接抑制TGF— B 的mRNA和蛋白表达从而达到防治糖尿病肾纤维化的目 的。关于这一点尚有待进一步的研究。