大黄素的高效提取及其NMR结构探索研究

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大黄素的高效提取及其NMR结构探索研究
大黄素(Emodin)(化学名为1，3，8一三羟基一 6一甲基蒽醌)是从蓼科植物虎杖(Polyonum cuspi， datum Sieb．et Zucc)中提取的一种蒽醌类化合物，具有免疫调节、抗菌、抗炎和抗肿瘤等多方面的药理作用l_2J。主要提取方法有溶剂法、水蒸气蒸馏法和超临界萃取法等，其中溶剂提取法比较常用_3 J。文献报道的大黄素的分析方法大多采用定量分析法 4 J，有关大黄素结构的定性分析尚未见报道。本文采用浸渍、加热回流及柱层析法从虎杖中高效提取和纯化获得了大黄素，采用 lD和2D NMR分析方法对大黄素氢谱、碳谱进行完整归属。通过NMR变温技术及NOESY的研究确定3一位羟基为活泼性部位，为大黄素的化学结构修饰提供依据。 1 实验部分 1．1 仪器与材料虎杖(Polyonum cuspidatum Sieb．et Zucc)购于南京中西医结合医院；柱层析采用100—200、200 — 300目硅胶(青岛海洋化工厂生产)；乙醇、硫酸、环己烷、丙酮、二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯等试剂均为市售化学纯或分析纯产品。AV一500型核磁共振仪(瑞士Bruker公司)；Shimadzu GCIMS — QP2010气质联用仪。 1．2 提取与纯化从虎杖中提取高纯度大黄素的方法：① 取虎杖饮片500 g，加入95％乙醇4 000 mL浸泡4 h，加热回流4 h，过滤除去药渣，滤液浓缩至50 mL，回收大部分乙醇，回流2次合并浓缩液；②浓缩液加水1 500 mL稀释，再加入50％硫酸30 mL，调节 pH至2，将该溶液加热进行水解反应1 h，待红色絮状物出现，继续加热至不再有明显絮状物生成，停止反应。过滤，除去滤液得水解产物；③ 水解产物加水50 mL搅匀，离心除去上清液，经过反复3 次水洗后即得大黄素粗品。称取硅胶120 g溶于丙酮装柱，将大黄素粗品与硅胶按1：1的比例混合制砂，加入少量丙酮研磨，使大黄素粗品与硅胶混合均匀，装入层析柱，以环己烷／丙酮混合溶剂(环己烷：丙酮为5： 1)进行洗脱，洗脱过程中用薄层板点样跟踪。当含有大黄素的洗脱液从层析柱中流出时开始收集，直至洗脱液中不含有大黄素时停止收集，将收集的洗脱液蒸馏、干燥获得粗品。以95％乙醇重结晶，于3 oC静置8～10 h时，析晶，过滤，得黄色针状结晶物，高效液相色谱测试提取得到的大黄素纯度高于99．0％。 1．3 NMR实验方法取结晶产物0．7 mg左右溶解于氘代二甲基亚砜0．5 mL中，将溶液置人直径5 InII1标准样品管中，采用Bruker标准脉冲程序，常规条件下测得氢谱、碳谱、DEPT谱、COSY谱、HSQC谱和HMBC 谱。选择性HMBC测定条件为：氢谱谱宽设定为仅包含4个不饱和质子的区域，碳谱谱宽设定为不饱和碳区域，采样次数32128，傅里叶变换矩阵为1024512。 NOESY测定条件为：1DNOESY选择照射甲基质子，采样次数64次，脉冲程序采用selgr- NOESY；2D—NOESY采样次数8256，脉冲间隔时问3 s，NOESY混合时间设为0．8 S，脉冲程序采用 gs．NOESY，傅里叶变换矩阵为lK1K。 NMR变温技术：探头温度控制在293K的条件下，测得氢谱，然后逐步升温，温度每升高10K 稳定10 min后，再次测定氢谱。温度最终升高到 363 K，测得系列氢谱。 2 一维和二维NMR谱的数据分析 2．1 HNMR、COSY及NOESY分析 H NMR谱中，．5l为DMSO 的溶剂峰，6 3．31为水峰，饱和区除这2个峰外，．39的一个单峰其积分值为3，代表结构中的甲基质子，归属为6．CH3。不饱和区有4组峰，分别代表结构中A 环和c环未被取代的4个不饱和次甲基质子，由于这4组峰化学位移比较接近，直接通过氢谱不能确定未被取代的4个不饱和次甲基质子对应的化学位移。低场区还有2个单峰和一个宽峰，代表3个羟基质子，直接通过氢谱对其化学位移也不能明确归属。 H-HCOSY谱中只有2组较弱的相关峰，即占6．56与6，7．08彼此相关，胡．12与67．44彼此相关，从偶合峰的强度可以看出这2组相关峰比较弱，可以判断这2组峰并非由直接相关所产生，而是由远程偶合所形成。H—HCOSY给出的信息只能将4组峰区分为彼此相关的2组，H HCOSY仍然不能确定4个不饱和次甲基质子对应的化学位移。因此，进一步测定大黄素的NOESY谱，通过测定这些质子的空间位置关系，来确定相应的化学位移。插页Ⅲ图1为NOESY局部放大图，其中图la 中，．39的甲基与6，7．12与．44相关，相关峰的强度几乎相同，插页Ⅲ图2所示的1DNOE差谱中，通过照射62．39的甲基，定量测试出．12与．44的NOE效应分别为5．30％和5．64％，由此判断．12与 7．44位于fj2．39的两侧，且与6 2．39的甲基在空间上相隔的距离非常接近。图 1b中811．97与．12相关，表明811．97的羟基与． 12在空问上比较靠近。NOESY分析表明． 39、．12、．44与811．97为c环的质子。从空间位置关系可知：811．97为8位羟基氢，．12为 7位质子，．44为5位质子。图1b中，．56、．08与811．33相关，且相关峰的强度相差不多，表明 11．33与．56及 6，7．08在空间上比较靠近，由此判断．12与6 7．44位于811．33的两侧，且与811．33的羟基在空间上相隔的距离比较接近。图1b中，812．04与． 56相关，表明这2组质子在空间上彼此靠近。根据NOESY空间位置关系，可以确定812．04 为l 位的羟基氢，811．33为3位的羟基氢，．08为4 位的不饱和次甲基质子，艿6．56为2位的不饱和次甲基质子。 2．2 bC-NMR 、DEtrI'、HSQC及HMBC分析 C．NMR谱中，839．7为DMSO的溶剂峰， DEPT表明没有亚甲基，有1个甲基和4个次甲基。HSQC中，821．63与 2．39的甲基质子直接相关，因此确定为与6位碳相连的甲基碳。其余4 个不饱和次甲基碳依据HSQC谱可以明确归属。 HMBC中，1位和8位的羟基分别与8164．58、 8161．54的季碳有较强的远程偶合峰，因此6 164．58归属为C1，8161．54归属为C8，．39的甲基与8148．33的季碳有很强的远程偶合峰，故 8148．33归属为c6。8109．04的季碳与5位和7位的质子有较强的远程偶合峰，依据取代苯环中处于间位的质子偶合较强的特征，8109．04 归属为 C8 ，同理6113．43的季碳归属为C9。。常规HMBC 中，8165．70的季碳与2位和4位的质子有较弱的远程偶合峰，属于邻位的远程偶合，6165．70可归属为C ，而4a和10a位的2个季碳没有检测到远程偶合峰，这2个季碳不能明确归属。选择性 HMBC中，8135．17的季碳与4位的质子有远程偶合峰，因此8135．17归属为c4 ， 132．88的季碳则归属为C 9位和10位的2个羰基碳依据HM— BC容易确定。 2．3 H．NMR和 C—NMR谱的归属综合以上分析，大黄素的 H和 c谱的归属见表1和表2。 3 NMR变温技术研究活性部位表3列出了大黄素的3个羟基氢在不同温度下的化学位移，从表中的数据可以看出，随着温度的不断上升这3个羟基的化学位移值逐步减小，但是他们化学位移值减少的幅度并不相同。其中 1一位和8一位的羟基下降的幅度较小，从293 K 到363 K累计下降0．06 ppm，而3一位的羟基下降的幅度较大，从293 K到363 K累计下降0．41 ppm。我们推测1一位和8一位的羟基与9一位的羰基形成分子内氢键，结构十分稳定，而3一位的羟基具有很强的活泼性。插页Ⅳ 图3为大黄素的3个羟基氢在不同温度下的氢谱，从谱图中可以看出，随着温度的不断增加，1一位和8一位的羟基的化学位移和谱峰的形状没有明显的变化，但是3一位羟基峰却逐步向高场漂移，并且谱峰也不断展宽。比较3个羟基的谱峰形状可知，1一位和8一位的羟基谱峰尖锐，也表明这2个羟基氢在溶液中相对固定，随整个分子一起运动。而3一位的羟基谱峰较宽，且随着温度的增加不断展宽，因此该羟基在溶液中极为活泼。大黄素的理化性质表明，几乎不溶于水，图 1a所示的NOESY谱中，．56、．08与 3．31相关，且相关峰的强度没有明显差别，这说明2位和 4位的质子与水分子的质子在空间上比较靠近，这表明大黄素尽管不溶于水，但在分子中存在一定量的吸附水或者是结晶水。根据NOESY给出的空间位置关系，吸附水或者是结晶水显然结合在3一位的羟基。NMR的研究结果表明，大黄素的结构中3一位羟基氢是极具活性的。 4 讨论大黄素作为羟基蒽醌类化合物，分子结构的一侧有亲脂性的甲基，而另一侧连接亲水性的羟基，另外在1一位和8一位上有二个酚羟基为亲水性基团，但这两个羟基与9一位羰基形成稳定的分子内氢键而使其亲水性减弱。这种特殊的结构特征使其有别于一些脂环类或芳香类极性小的化合物，在氯仿、乙醚等亲脂性溶剂中其溶解性较差；也有别于糖苷、氨基酸等多羟基化合物，大黄素在水中的溶解性也很差。在采用NMR变温技术动态研究大黄素活性部位过程中，温度从293 K升温至363 K时，1一位和8一位的羟基虽然下降的幅度较小，但随着温度的不断升高，其峰形已逐渐展宽，特别是当温度升高到243 K以上时，谱峰展宽现象开始变得明显。说明1一位和8一位的羟基与9一位的羰基所形成的分子内氢键随着温度的不断升高，其稳定性呈减弱趋势，当温度达到一定的高度后，分子内氢键遭到破坏，1一位和8一位的羟基也成为活泼性部位。在课题组进一步的研究中，我们将在其活泼性部位引入水溶性取代基团，以增强化合物的水溶性和溶解性，并期望通过结构修饰改变其极性，增强化合物的脂溶性，探索研究其抗肿瘤活性及其作用机制。综上，我们通过NMR定性研究大黄素的结构以及大黄素结构中的活泼性部位，为其抗肿瘤活性研究提供了物质基础。在此基础上，进一步研究将分别在1一位、3一位和8一位上引入各种取代基团，通过对多羟基蒽醌的结构修饰及其衍生物的合成和生物活性研究，寻找探索活性高，毒副作用小的取代蒽醌类候选新药。