关键词:银杏内酯A 海马神经细胞 SNP 凋亡

 Protection of Ginkgolides A Against Apoptosis of Hippocampal Neurons

 Abstract:Objective Study the effects and mechanism of GKA against apoptosis of hippocampal neurons. Methods Neuronal viabihty was tested by MTT assay. After pre-treated with 0. 1,1,10 μmol/L GKA for 6 h, neurons were incubated with 50 μmol/L SNP for 24 h. The apoptosis of neurons were analyzed with flow cytometry;the expression levels of bcl-2 ,bax and cpp32 in mRNA and protein were analyzed with RT-PCR and Western blot. The activity of Cpp32 was determined by Kits. Results The apoptosis rates of GKA treated groups were lower than that of SNP group significantly（P 〈0.01 ） ;RT-PCR and Western blots indicated that GKA could counteract SNP and up-regulate the expressions of bcl-2 ,down-regulated the expressions of bax and not affect the expressions of cpp32 ;but GKA. could reduce the activity of Cpp32 significantly（ P 〈 0. 01 ）. Conclusions GKA can counteract the effects of SNP and protect hippocampal neurons against apoptosis.

 Key words:GKA ; hippocampal neurons ; SNP; apoptosis

 阿尔茨海默病(Alzheimerg disease，AD)的确切发病机制尚 未完全清楚。“氧化应激假说”认为，NO能与超氧化物反应， 产生过氧化亚硝酸盐，促使蛋白质氧化、脂质过氧化和DNA损 伤，这些最终导致神经细胞死亡” 。银杏内酯(ginkgolides， GK)是银杏叶提取物的主要成分之一，是一组具有较强生物活 性的萜类化合物，包括银杏内酯A、B、C、J和M(GKA、GKB、 GKC、GKJ、GKM)等。近年来，国内外对GK的药理作用进行了 大量的研究，其药理作用广泛。目前GK已应用于治疗心血管 病，但对原代培养的海马神经细胞影响研究很少。本研究利用 已建立的海马神经细胞凋亡模型，探讨GKA对凋亡神经细胞 的保护作用及其机制。

 1 材料与方法

 1．1 材料

 新生(出生24 h内)SD大鼠，为广东医学院实验 动物中心提供。各种细胞培养所用试剂均为Invitrigen公司产 品；SNP、胰酶、阿糖胞苷、多聚赖氨酸均为Sigma产品；GKA为 深圳纳琦科技有限公司产品，批号：060508；各种抗体及ECL试 剂为R&D公司产品；Quantscript cDNA第一链合成试剂盒为 Qiagene公司产品；Cpp32活性检测试剂盒为Promega公司产 品；其余试剂为国产分析纯。

 1．2 GKA对海马神经细胞存活率的影响

 参考文献H 的方 法，培养海马神经细胞，培养至海马神经细胞发育成熟，性状稳 定，用于实验；接种神经细胞于96孔板中，培养12 d，经终浓度 为0．1、1、10和100 p~mol／L GKA作用24 h，向每孔加入MTT(5 mg／m1)20 ，继续培养4 h，弃培养基，用无血清培养基洗1 次，加入MTT裂解液100 l，37℃ 、5％CO 孵育8 h，紫色结晶 完全溶解后，用酶标仪检测各组细胞的570 nm和450 nm吸光 值，以A 。／A 比值代表细胞活力，溶剂对照组细胞生长率为 100％ ，其余各组按生长率=(各浓度组吸光值／溶剂对照组吸 光值)×100％与之比较，作图。

 1．3 GKA处理神经细胞

 取培养12 d的海马神经细胞，用 0．1、1、10、100 Vumol／L的GKA预处理6 h，弃培养液，用无血清 DMEM洗3次，换无血清DMEM，补加原剂量的GKA，再加50 v~mol／L SNP，继续培养24 h，收集细胞进行实验。每次实验均 分对照组(DMSO对照)、SNP处理组及实验组(GKA+SNP)，每 组至少重复3次。GKA用DMSO溶解，DMSO终浓度为0．1％。

 1．4 流式细胞术试验

 取对照组及各实验组细胞样品， 800 r／min离心10 min，收集细胞，PBS洗2次在4~E下，用70％ (V／V)的乙醇固定24 h，终浓度为50 mg／L的RNA酶37℃消 化1 h，终浓度50 mg／L的碘化丙锭(PI)4~C。染色30 rain，流式 细胞仪测定细胞凋亡。

 1．5 RT—PCR分析6cZ一2、bax、cpp32基因mRNA表达

 按Trizol 试剂盒说明书提取总RNA。用紫外分光光度计测定A260／ A280，比值在1．7～2．0之间，计算RNA含量。引物设计根据各个基因mRNA全长，用PrimerPremier5和Ohgo6进行设计，见 表1。

 表1 各基因引物序列及PCR产物长度

 逆转录体系：10×逆转录混合液2 o．1、dNTP混合液0．5 、 oug0 dT15 2 o．1、M—MLV (200 u／o．1)1 o．1、无RNA酶的水 9．5 o．1、RNA模板5 (2 )，总体积20 ，稍离心后混匀， 37℃孵育60 min。合成的cDNA产物于一20~C保存备用。PCR 反应体系：cDNA产物5 、加10×缓冲液5 o．1、dNTP混合液1 、各种基因的正、反向引物各1 o．1，Taq酶(2．5 u／o．1)1 o．1、超 纯水36 ，总体50 ，于PE2400型PCR仪上进行PCR。反应 条件：95℃ 2 min预变性；94oC45 s、57oC45 s、72oC45 s共35个 循环，最后72~C延伸10 min，4~C保存，PCR产物用2％琼脂糖 凝胶电泳分离检测。

 1．6 Western blots分析Bcl-2、Bax、Cpp32蛋白表达

 按Westem blot标准程序进行，每孔上样50 蛋白量，12．5％ SDS． PAGE，恒压200 V电泳45 min分离样品；4℃ ，100 V×3 h将蛋 白转至NC膜上，用封闭液室温封闭2 h，将膜与含一抗的封闭 液(兔抗大鼠Bcl-2单克隆抗体1：4OO．／J、鼠抗大鼠Bax单克隆 抗体1：500；兔抗大鼠cpp32多克隆抗体1：4OO)室温孵育2 h， PBS洗5 min×3次，TBS洗5 min×3次，除去过量的一抗；将膜 与含二抗的稀释液室温孵浴1 h，TBS洗5 min×3次，将膜装入 可热封口的塑料袋中，加入ECL试剂，暗室暴光，显影，定影，x 光底片扫描，保存。

 1．7 Cpp32活性分析

 按试剂盒说明书进行操作，测定 caspase 3的酶活性。酶标仪测定A ，以50 I~mol／L SNP处理 组为参照组，其酶活性为100％ ，其余各组按酶活性：各浓度组 吸光值／对照组吸光值×100％ ，作图。

 2 结果

 2．1 GKA对神经细胞存活率的影响

 对照组、DMSO组及 0．1、1、10、100 I~mol／L GKA处理组存活率(％)分别为100．0 4- 3．2，99．8 4-3．6，97．8 4-7．8，99．3 4-9．1，105．0 ±10．2，85．4 ± 8．1。与正常对照组相比，DMSO组及0．1、1、10 I~mol／LGKA处 理组差别无显著性(P>0．05)，但100 I~mol／L GKA处理组差 别有显著性(P<0．05)；因此认为溶剂0．1％DMSO和0．1～10 I~mol／L GKA处理组不影响神经细胞存活，100 gmol／L GKA处 理降低了神经细胞存活率，故后续实验只采用0．1、110 I~mol／L GKA。

 2．2 GKA对NO神经毒性的保护作用

 培养的海马神经细胞 用不同剂量(0．1、1、10 I~mol／L)的GKA预处理6 h，加入50 mol／L的SNP 24 h后海马神经细胞的存活率(％)分别为 68．4±4．1、78．6±4．5、98．4±6．2，随GKA剂量的增大而升高， 具有量效依赖性；与SNP组(57．6±3．7)比较，各组神经细胞存 活率差异有显著性(P<0．05)。表明0．1 gmol／L的GKA即具 有保护作用。

 2．3 流式细胞术检测细胞凋亡

 用50 I~mol／L SNP处理细 胞，凋亡率(％)为22．6±5．1，与对照组(3．8±2．0)比较凋亡 增加(P<0．01)；不同浓度GKA对SNP诱导的凋亡细胞均有 显著抑制作用(P<0．01)，且随GKA剂量增加，呈剂量依赖关 系；各实验组细胞凋亡率分别为：l3．8±4．3、7．7±3．5和6．0± 3．1，与50 I~mol／L SNP组(凋亡率为22．6±5．1)比较差异显著 (P<0．01)；但不同浓度GKA实验组与对照组比较仍有显著性 差异(P<0．01)，表明GKA未能完全抑制SNP诱导的海马神 经细胞凋亡。

 2．4 GKA对6cZ-2、bax、cpp32基因mRNA表达影响

 RT—PCR 结果(见图1)显示，用0．1、1、10 I~mol／L的GKA预处理海马神 经细胞6 h，bcl一2 PCR产物的条带逐渐变亮，bax PCR产物的条 带逐渐变淡，cpp32 PCR产物的条带亮度无变化，说明随着药物 浓度的增加， -2 mRNA表达增加，bax mRNA的表达下降，但 cpp32 PCR产物变化不明显。

 A、B、c分别为逆转录之后 -2，bax，cpp32 PCR产物电泳图，图上方 条带为内参基因gapdh，下方为各基因；D为3种基因条带与各自泳 道内参基因条带灰度分析图，Con：对照组。

 图1 bcl-2、bax、cpp32 PCR产物电泳及灰度扫描分析

 2．5 GKA对Bcl-2、Bax蛋白表达影响

 Western blot结果(见 图2)显示，用0．1、1、10 I~mol／L的GKA预处理海马神经细胞6 h，Bcl-2蛋白条带逐渐变粗，Bax蛋白条带逐渐变细，Cpp32蛋 白条带变化不明显；说明随着药物浓度的增加，Bcl-2蛋白表达增强，Cpp32蛋白表达变化不明显。

 A、B、C分别为Bcl-2、Bax、Cpp32 Western Blot图，D为各蛋白灰度扫 描分析图

 图2 Ikl-2、Bax、Cpp32 Western Blot图及灰度扫描分析

 2．6 Cpp32活性分析

 用0．1、1、10~mol／L的GKA预处理海 马神经细胞6 h，与SNP组A405(0．601±0．034)比较，各实验组 A (0．412±0．025，0．309±0．018，0．189±0．013)均显著降低 (P<0．01)，与对照组(0．051±0．009)比较，各实验组Cpp32 活性均显著升高(P<0．01)；说明各浓度GKA能够在一定程度 上抑制由SNP诱导的海马神经细胞凋亡，但又不能完全阻止其 凋亡。

 3 讨论

 近年来，许多研究指出氧化失衡作用是AD发病机制中关 键事件，是可用来监视体内氧化应激特异和灵敏的标记可帮助 诊断AD。从目前已有的证据表明，氧化失衡及随后的氧化应 激是AD发展的早期事件，并且是只存在于AD而不存在其他 神经变性疾病的特异性制。新观点认为氧化失衡及氧化应激 在AD发病中起的作用比早先预计的更重要，任何涉及针对氧 化应激的治疗都应该是在AD最早阶段

 2004年Bate等 研究表明经GK预处理的神经细胞可抵 抗AB。 ，神经细胞存活率随GK浓度增加而升高；GK可保护 SH—SY5H神经瘤细胞对抗血小板聚积因子和花生四烯酸的毒 性；GK可使神经细胞降低前列腺素E 产量，而前列腺素E 产 量是与细胞死亡密切相关的指标；GK可降低培养皮质神经细 胞中capase一3活性 J。2005年孟青等 研究表明银杏内酯治 疗组较模型组大鼠空间学习记忆能力明显增强(P<0．b5)，HE 染色显示银杏内酯治疗组神经细胞变性及坏死较模型组减少 明显，因此认为银杏内酯可提高拟AD模型鼠的学习、记忆能力。2006年Wu等 报道，银杏叶提取物EGb 761及其主要组 分GKA可减轻AB诱导转基因线虫的病理学行为；同时也可抑 制AB在线虫体内的寡聚化和沉积。因此他们认为EGb 761及 GKA具有预防和治疗AD的潜能。

 本研究发现GKA能在一定程度上抑制SNP对海马神经细 胞的凋亡作用，GKA对抗SNP所致的海马神经细胞毒性，其机 制与增加抗凋亡基因6cz一2的表达，降低凋亡基因bax表达及降 低cpp32活性有关。研究表明 】，Bcl一2蛋白作用点位于多条 凋亡通路下游共同通道上，能抑制多种因素诱发的细胞凋亡， 但必须形成同源二聚体Bcl一2／Bcl一2；Bax单独存在时，会形成同 源二聚体Bax／Bax，可促进细胞凋亡，当Bcl一2存在时与之形成 Bcl一2／Bax异源二聚体，Bcl一2的抗凋亡作用也会丧失；Cpp32是 凋亡最终的效应分子，由它来切割蛋白，导致蛋白降解、核膜裂 解，促进DNA片段化。本研究用GKA预处理海马神经细胞 6h，可抵抗SNP的神经毒性，一方面，增加了Bcl一2表达，降低了 Bax表达，使Bcl一2／Bcl一2增加，Bax／Bax和Bcl-2／Bax下降，总效 应是抑制神经细胞凋亡；另一方面，GKA还可以降低凋亡效应 分子Cpp32活性，也在一定程度上抑制了凋亡的发生。从以往 研究和本研究可以表明GKA是可以抑制神经细胞凋亡，在一 定程度上可延缓AD的发生和发展，所以GKA作为一种预防和 治疗AD的潜在药物值得期待。