| 当前位置 : 首 页 >> 银杏内酯B >> 正文阅读 |
 |
| 甲磺酸胺银杏内酯B冻干粉针的大鼠胚胎-胎仔发育毒性和遗传毒性实验研究 |
甲磺酸胺银杏内酯B冻干粉针的主要成分是甲
磺酸胺银杏内酯B(dimethylamin0ethyl ginkgolide B
mesylate)，化学名称为10一O (N，N‘二甲胺基乙基)一银
杏内酯B甲磺酸盐。甲磺酸胺银杏内酯B是由银杏
内酯B结构修饰而成的抗血小板活化因子的化学药
物¨ 。其由于水溶性好，故做成冻干粉针，用于缺血
性脑血管病急性发作期，已作为一类新药注册申报。
为了保证供试品的安全使用，了解有无潜在的致畸作
用，我们对其进行了大鼠的胚胎一胎仔发育毒性实验研
究，同时采用常规遗传毒性试验方法，观察其是否具有
潜在的遗传毒性。
1 材料与方法
1．1 药物
甲磺酸胺银杏内酯B冻干粉针由江苏柯菲平医
药有限公司提供，规格为每瓶40 mg；批号为061001。
实验时用0．9％氯化钠注射液稀释配成所需的受试
药液。
1．2 动物
SPF级SD大鼠，雌鼠150只(体重210～230 g)，
雄鼠75只(体重255～280 g)，由上海斯莱克实验动物
有限责任公司提供，合格证号SCXK(沪)2007—0003；
清洁级ICR小鼠，雄性，6周龄，体重22—26 g，合格证
号SCXK(苏)2002—0031，购自南京医科大学实验动物
中心。动物房室温控制在20～26℃ ，相对湿度为
40％ 一70％ 。所有孕鼠用全价颗粒饲料喂养，动物进
入动物室后适应环境1周。组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门
菌(S．Typhimurium)TA97、TA98、TA100、rrA102、
TA1535，上海市疾病预防控制中心提供；中国仓鼠肺
成纤维细胞(CHL)，江苏省药品检验所提供。
1．3 方法
1．3．1 大鼠胚胎一胎仔发育毒性试验SD大鼠按雄
与雌1：2合笼，合笼时间5 d，对雌鼠的阴道涂片进行显
微镜检查，查见精子者定为妊娠0 d。将孕鼠随机分为
溶剂对照组、环磷酰胺(CP)阳性对照组以及甲磺酸胺
银杏内酯B高、中、低剂量组，每组20只。各组依次尾静脉注射(iv)5 m1．kg 注射用生理盐水、2．8 mg·
kg 注射用cP和100、50、25 mg·kg 甲磺酸胺银杏
内酯B冻于粉针，于妊娠6～15 d连续给药，每天iv给
药1次，连续给药10 d。每天观察孕鼠的摄食、饮水、
生长等一般状况，于妊娠0、3、7、10、13、16、20 d称取
体重。妊娠20 d处死孕鼠，记录黄体数、死胎数、着床
数、吸收胎数、活胎数以及活胎体重、性别、外观异常
等。约1／2胎仔固定于Bouin液作内脏检查，另1／2
固定于70％酒精作骨骼畸形检查。
1．3．2 Ames试验 试验采用TA97、TA98、TA100、
TA102、TA1535 5株菌，标准平皿掺人法，在加s9和不
加s9的平行条件下测试。试验浓度依次为每皿
5 000、2 000 500 200 50 Ixg
1．3．3 CHL染色体畸变试验先测定50％ 生长抑制
浓度(IC∞)，根据Ic5。确定试验浓度为800、4OO、
200 ·ml～。CHL置培养瓶中培养72 h后换液，加入
受试物。另设溶剂对照、阳性对照和空白对照组。阳性
药分别为：一S9即丝裂霉素(MMC，0．4 Ixg·ml )和
+s9即CP(20 g·ml )。加s9组另加0．5 ml s9混
合物，用1640培养液在37℃培养6 h后换液，继续培养
】8 h收获细胞；不加S9组药物接触细胞24和48 h后收
获细胞。在收获细胞前4 h加入秋水仙碱(0．2 txg·
ml )。细胞经甲醇冰醋酸固定，Giemsa染色。每一剂
量组观察100个中期分裂相细胞，记录细胞染色体的数
目或结构异常，以百分率表示细胞畸变率。
1．3．4 小鼠骨髓微核试验 ICR小鼠50只，随
机分为5组，每组1O只。小鼠静脉注射本品急性毒
性LD 为520．99 mg·kg～。小鼠微核试验剂量设
为260、130和65 mg·kg～。另设生理盐水溶剂对
照组和CP阳性对照组(40 mg·kg )。小鼠静脉注
射给药，每天给药1次，连续3 d。末次给药后24 h
采集股骨骨髓涂片，甲醇固定，Giemsa染色。在油镜
下每只动物观察2 000个嗜多染红细胞(PCE)，记录
含微核细胞数。同时观察200个嗜多染红细胞
(PCE)计数中见到的幼红细胞(NCE)数，计算PCE／
NCE值。
1．4 统计学处理
孕鼠的体重、摄食量、黄体数、胎盘重，胎鼠的身
长、尾长、体重，窝平均活胎数均用t检验；胎鼠的吸收
率、死胎率及骨骼、脏器的畸形率、微核试验采用
检验。
2 结 果
2．1 对大鼠胚胎-胎仔发育的影响
2．1．1 动物一般状况观察给药期间对每只大鼠进行观察，未见流产、脱毛、窒息、厌食、共济失调、发绀、
立毛、皮毛粗糙、惊厥、呼吸困难、鼻出血、凸眼、流泪、
眼睛分泌物增多、活动过强、活动抑制、旋转、嗜眠、腹
泻、粪便和尿液等排出物中带血或其他颜色等中毒症
状。与溶剂对照组相比，高、中、低剂量甲磺酸胺银杏
内酯B组孕鼠体重增加无显著差异(P>0．05)。而
CP组与溶剂对照组相比，13 d以后体重增加明显抑
制，体重增加幅度明显低于溶剂对照组，具有显著差异
(P<0．O1或P<0．05)。于妊娠0、3、6、10、13、16、
19 d分别记录加食量，次日称取剩食量，计算耗食量，
各剂量组与溶剂对照组相比无显著差异。CP组在
13 d耗食量明显低于溶剂对照组(P<0．O1)，其他时
间无显著差异。
2．1．2 甲磺酸胺银杏内酯B对胚胎形成的影响母
体检查结果见表1。CP组的活胎数、吸收胎数、黄体
数、子宫总重及胎盘总重低于溶剂对照组，有统计学差
异(P<0．05或P<0．001)。高剂量组和中剂量组吸
收胎数与溶剂对照组相比，有统计学差异(P<0．05)，
低剂量组与溶剂对照组相比未见统计学差异。CP组
和低剂量组分别有死胎1例，与溶剂对照组比，未见统
计学差异。高、中、低剂量用药组与溶剂对照组相比，
着床总数未见异常。
2．1．3 甲磺酸胺银杏内酯B对胎鼠生长发育的影响
除甲磺酸胺银杏内酯B 50 mg·kg 组对胎鼠尾长
有抑制(P<0．05)外，与溶剂对照组相比，甲磺酸胺银
杏内酯B其余剂量组对胎鼠身长、尾长和体重均未见
明显影响(P>0．05)。CP组则抑制胎鼠生长发育，对
胎鼠身长、尾长、体重均有明显影响，与溶剂对照组相
比有统计学差异(P<0．001)。外观畸形发生率：CP
组除2例无尾、1例足内翻(P>0．05)外，未见其他外
观畸形发生(表2)。
2．1．4 甲磺酸胺银杏内酯B对胎鼠内脏和骨骼畸形
的影响采用胎鼠徒手切片法进行内脏检查，结果：除
CP组出现腭裂1例、无眼1例、肾积水3例外，溶剂对
照组和甲磺酸胺银杏内酯B高剂量组中未见内脏畸
形，因此甲磺酸胺银杏内酯B中、低剂量组未作检查。
甲磺酸胺银杏内酯B高剂量组的胸骨畸形(5例子代
胸骨骨化不全，18例第5胸骨节缺失)与溶剂对照组
相比有显著差异(P<0．001)；另有5例枕骨I级骨化
不全，与溶剂对照组相比无显著差异(P>0．05)。中
剂量组的胸骨畸形(3例子代胸骨骨化不全，l3例第5
胸骨节缺失)与溶剂对照组相比有显著差异(P<
0．05)；另有7例子代枕骨骨化不全，与溶剂对照组相
比无显著差异(P>0．05)。低剂量组出现1例子代枕
骨骨化不全，1例子代胸骨骨化不全，4例第5胸骨节缺失，与溶剂对照组相比无显著差异(P>0．05)。CP
组有5 l例子代枕骨骨化不全，部分枕骨只有两个较大
的骨化点，30例子代胸骨骨化不全，44例第5胸骨节缺失，与溶剂对照组相比均有显著差异(P<0．001)，
另有1例肋骨13肋短小，1例有l4肋，与溶剂对照组
相比无统计学差异。
2．2 对鼠伤寒沙门菌回复突变菌落数的影响
甲磺酸胺银杏内酯B各剂量组平板背景菌苔正
常。菌落计数表明，5个剂量组中TA97、TA98、
TA100、TA102和TA1535 5株菌，在加和不加s9条件
下的回复突变菌落数未见剂量依赖性增加，各阳性对
照组回复突变菌落数明显增加(表3)。因此，甲磺酸
胺银杏内酯B对组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门菌无
诱发回变作用。
2．3 对CHL染色体数目和结构的影响
不加s9条件下，细胞接触甲磺酸胺银杏内酯B
24 h，剂量为800、400和200 lxg·ml 时的细胞染色
体畸变率依次为0、1％和2％。接触48 h时，高、中和
低3个剂量的细胞染色体畸变率依次为1％、0和0，
未呈现剂量依赖性增加。阳性对照组24和48 h的细胞染色体畸变率分别为20％和38％ 。加s9条件下，
细胞接触同样剂量的甲磺酸胺银杏内酯6 h，随后继续
培养18 h，高、中和低剂量组的细胞染色体畸变率依次
为2％ 、2％和0，未呈现剂量依赖性增加。而阳性对照
组的畸变率为29％。因此，甲磺酸胺银杏内酯B的染
色体畸变试验结果为阴性。
2．4 对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核的影响
给药期问及给药结束观察，甲磺酸胺银杏内酯B
各剂量组小鼠、溶剂对照组小鼠和CP组小鼠外观及
行为活动均未出现异常。经骨髓涂片微核计数，甲磺
酸胺银杏内酯B各剂量组与对照组比较，微核率无明
显差异，嗜多染红细胞与幼红细胞比例也未见明显改
变(表4)。
3 讨 论
银杏内酯B是中药银杏叶提取物的主要活性成
分之一，可以抑制血小板聚集、抗炎、抗休克、保护心脑
血管及治疗急性胰腺炎等，是治疗急慢性脑缺血疾病
的有效药物 J。有报道显示，5 mg·kg 银杏内酯B
能降低大鼠血浆促炎因子含量，提高IL—l2和细胞因
子拮抗剂含量 ，8、4 mg·kg 银杏内酯B可明显减
少三氯化铁致大脑中动脉血栓形成局灶性脑缺血大鼠
脑梗塞程度 ；银杏内酯B 10 I~mol·L 对缺血一再灌
注心肌损害具有明显的保护作用，其机制可能是拮抗
PAF和抑制自由基的产生 。因此，银杏内酯B有良
好的I临床应用前景。银杏内酯B化合物为白色结晶，
水溶性极小，临床作为注射剂使用受到一定的限制。
通过合成银杏内酯B衍生物(XQ)，解决了其水溶性
低的问题，具有更高的生物利用度。实验表明，XQ对PAF、ADP、AA、COL诱导的血小板聚集有抑制作用，其
中对PAF诱导剂的作用强于银杏内酯B，其作用机制
可能与拮抗PAF受体有关 。本研究从生殖毒理的
角度研究甲磺酸胺银杏内酯B冻干粉针的潜在胚胎一
胎仔发育毒性及安全使用剂量，并检测其是否存在潜
在的遗传毒性。
本研究表明，甲磺酸胺银杏内酯B冻干粉针对母
体一般状况和子代发育均安全的剂量为25 mg·kg～，
其剂量显著高于上述有效剂量。低剂量组虽有1例死
胎出现，但并无统计学意义。在本实验室以往的实验
中，空白对照组也偶有死胎出现，应属正常现象。遗传
毒性3项试验即Ames试验、细胞染色体畸变试验和
小鼠骨髓微核试验结果均为阴性，说明在目前试验条
件和剂量下，甲磺酸胺银杏内酯B无基因突变和染色
体畸变作用，即无明显致突变性。随着对其药理及毒
理学作用机制研究的深入，其临床应用范围不断扩大，可望成为一种具有开发前景的安全有效的药物。
|
|
|
|
