关键词:细胞间通讯 心肌细胞 银杏内酯B

 Effects of Ginkgolide B on Cell-cell Communication in Rat Cardiomyocytes

 Abstract：In present study，we observed effect of ginkgolide B(GB)on functions of gap junc— tions in rat cardiomyocytes using fluorescence redistribution after photobleaching under laser scanning confocal microscopy．The fluorescence of cells dyeing CFDA was bleached with pow— erful laser and fluorescence recovery rate was ． recorded．Results showed that fluorescence recov— ery in rat cardiomyocyte appeared after bleaching．GB could inhibit fluorescence recovery rate of the cells after laser bleaching．Our data indecated that GB might inhibit cell—cell communication via pathway of changing function of Gap j unctions．

 Key words：Cell—cell communication； Cardiomyocytes； Ginkgolide B

 细胞间的缝隙连接(gap junction)是相邻细胞 之间信息通讯的重要结构之一_1]，心肌细胞缝隙连 接介导的细胞间通讯在保证电机械偶连活动和心 肌细胞的分化、增殖上有重要作用_2]。目前多数研 究表明，细胞间的缝隙连接是传递细胞生长调控信 号的结构，缝隙连接功能的损害可以导致细胞生长 的异常，细胞丢失和生长抑制_3]。本研究利用荧光 光漂白后荧光重新分布技术(FRAP)观察了体外 培养的大鼠心肌细胞通讯功能并探讨了银杏内酯 B对大鼠心肌细胞通讯功能的影响。

 材料与方法

 1 激光扫描共聚焦显微镜

 ACAS ULTIMA型激光扫描共聚焦显微镜，购自美国MERIDIAN公司。光源部分的氩离子 激光器由双声光调制器控制激光的脉冲强度和时 间，可以同时输出功率为50mW 紫外光(波长 351～364nm)、200mW 可见光(波长488、514nm) 的激发光。台阶／镜结合的双扫描系统，由侧窗式 三色同步光电倍增管检测荧光强度。

 2 心肌细胞培养和银杏内酯B对心肌细胞的 作用

 取1～4d的SD雄性大鼠心室放入MEM 培 养液中，以D-Hank’S液洗两次后剪成1 mm。块， 加0．1 胰蛋白酶，置37℃ 水浴消化30min，将小 块组织放于250目钢丝网上用玻璃棒轻轻涂抹后 以培养液冲洗，收集过网液体，离心(800 g) 10 min。以培养基悬浮细胞，按1×10 个细胞／ 孑L，接种于24孑L培养板，37℃ 、5 CO 的条件下静 置培养。24 h后，心肌细胞贴壁并单层散开，部分 聚集成团，48 h后，形成同心圆放射状细胞簇，簇间借伪足相互连接形成功能合胞体搏动，并相互 连接成网，至72 h细胞维持旺盛的代谢。在上述 培养板中分别加入银杏内酯B，终浓度为100 t~g／mL， 200／~g／mL，300／~g／mL，分别为A 组、B组和C 组，每一浓度组均设双孔。加入等体积细胞培养液 的双孔为对照组，培养12 h后PBS清洗2次，分别 对每组细胞进行荧光染色。

 3 荧光染料CFDA 的负载和心肌细胞缝隙 连接功能的测定

 CFDA(6一羟基双乙酸甲酯荧光素)，购自美国 Molecular Probes公司。将CFDA 粉剂溶于二甲 亚砜中配成1 rag／mL的储存液，染色时终浓度为 10mg／mL，37℃孵育15min，PBS清洗2次。在共 聚焦激光扫描显微镜下采用FRAP技术对心肌细 胞进行检测。FRAP技术原理是用高强度脉冲激 光照射细胞的某一区域，造成该区域荧光淬灭，检 测该区域周围的荧光分子向该区域扩散的速率即 荧光恢复率( )。FRAP的激光功率为500 mw， 扫描强度为激光功率的10 ，荧光漂白强度为激 光功率的50 。漂白脉冲时间200 ms，细胞扫描 步进1．O0 m，每孔共扫描5组细胞，选择周围与 多个细胞紧密相连的单个细胞作为漂白对象，其中 设置单个游离细胞(不存在缝隙连接)为荧光漂白 无恢复对照组，以同一孔中不进行荧光漂白的细胞 作为背景校正。对所选定细胞进行荧光淬灭，完成 后实时监测9．2 rain，观察该细胞内荧光恢复情况， 计算机自动采集数据后计算荧光恢复速率平均百 分率，并自动以背景校正作为计算机图像处理的内 参照。

 讨 论

 细胞间通讯是组织中细胞与细胞之间相互影 响和调控的一个重要生物过程，其作用的结构基础 是相互接触细胞之间的浆膜结构即缝隙连接。缝 隙连接所形成的通道允许胞浆中的小分子物质(如 离子、细胞因子以及某些内生复合物的代谢产物， 外源性物质等)在相邻细胞之间自由弥散，是细胞 间通讯的重要结构。激光扫描共聚焦显微镜观察 荧光光漂白后荧光重新分布是检测细胞间通讯的 先进技术，利用此技术检测的实验结果具有高稳定 性和直观性[4]。受损的心肌细胞在病理状态下释 放各种细胞因子，同时分泌很多活性物质及细胞外 基质成分[5]，这些生物活性物质通过细胞间缝隙连 接传递给相邻细胞，使其它心肌细胞受到损伤，造 成心肌细胞凋亡、坏死。

 银杏内酯B是银杏叶提取物中的主要活性成 分之一，是一种天然的特异性血小板活化因子拮抗 剂[5]，具有抗炎、抗过敏、抗休克等广泛的生物学作 用，对缺血、缺氧等多种因素引起的心肌损伤有保 护作用。本研究表明，在体外培养的大鼠心肌细胞 之间存在着缝隙连接结构，不同浓度(100、200和 300mg／mL)的银杏内酯B可以抑制大鼠心肌细胞 荧光漂白后荧光恢复率，而且随着浓度越高抑制作 用越明显。从这一角度解释了银杏内酯B通过抑 制细胞间有害物质的交换，达到抑制心肌细胞凋亡 及坏死的发生，实现对心肌细胞的保护作用。