本文利用RP—HPLC／UV、示差折光(RI)、MS检 测等技术考察了GB与其衍生物的关系，初步阐明 了该衍生物的结构，通过考察温度、pH值、溶剂等对 GB和该衍生物的影响，阐述了GB和该衍生物之间 的变化规律。

 1 实验部分

 1．1 仪器与试剂

 供试原料：银杏叶提取物；银杏内酯B对照品(中国药品生物制品检定所(未开封)，批号为1 10863—200305)

 试剂：甲醇(色谱纯)，重蒸水，聚乙二醇600、四 氯化碳、苯、二氯甲烷、丙酮、氢氧化钠、盐酸、无水硫 酸钠、乙酸铅、活性炭、硅胶(100目)均为分析纯。

 仪器：高效液相色谱仪，包括Millennium 32系 统、515泵、996二极管阵列检测器和4l0型示差折 光检测器(美国Waters公司)；HP 1 100型液相色 谱一质谱联用仪，配G1314A VWD 紫外检测器、 G13 13A自动进样器和G1946B MSD电喷雾离子源 (ESI)(美国Agilent公司)；水浴锅；旋转蒸发器；半 制备色谱柱(ODS)(7．8 mm x 300 mm，5 m)。

 1．2 银杏内酯B的精制过程

 在50 L甲醇一水(体积比为70：30)中加入l0 干燥的银杏叶提取物，于70℃ 下回流提取6 h。提 取2次，合并提取液并过滤、浓缩至5 L，然后用四氯 化碳萃取2次，每次用2 L四氯化碳。移去四氯化 碳相，剩余液体用1 mol／L NaOH调节pH至8．5后 用苯萃取5次，每次用3 L苯，合并苯相并用无水硫 酸钠脱水，蒸干后得到粉末。苯提取后的剩余液体 用1 mol／L HC1调节pH至2后用二氯甲烷萃取3 次，每次用2 L二氯甲烷，合并二氯甲烷相并脱水、 蒸干，得到粉末。与前面得到的粉末合并，得到褐色 粉末。将粉末溶解在120 mL丙酮中，加入5％ 乙酸 铅水溶液适量，搅拌、放置、过滤，滤液浓缩干燥，得 -y-0 255 g银杏内酯粗品。在50 mL丙酮中加入100 g银杏内酯粗品，将溶液通过填充50 g活性炭和 1 kg硅胶的吸附柱，蒸发干燥流出液，得到18 g微 黄色粉末。将该粉末加入到50 mL无水乙醇中 ，在 60℃ 下加热完全溶解后，于低温放置l0 h，得到 l0 g白色无定形结晶为银杏内酯B样品。

 1．3 分析条件

 HPLC条件：色谱柱为Symmetry Shield Rp C 不锈钢柱(3．9 mm x 150 mm，5 m)，流动相为甲 醇一水(体积比为30：70)，流速为1．0 mL／min。

 RP—HPLC／UV条件：检测波长216 nm，波长扫 描范围200～400 nm，柱温为室温，进样量l0 L。

 RP—HPLC／RI：柱温为35℃ ，进样量为5 L。

 LC—MS条件：电喷雾电离源(ESI)，氮气速度为 7 L／min，质量扫描范围为m／z 50～1 000，电离模 式为正离子和负离子模式，电压为80 V。

 1．4 纯度测定

 精密称取银杏内酯B对照品和样品适量，置于5 mL 容量瓶中，以甲醇稀释至刻度，摇匀，制成1．0 g／L的溶液，外标法定量，GB 的纯度用RP—HPLC／UV 和RP—HPLC／RI法测定，结果分别为98．5％ 和 99．1％ 。

 1．5 半制备色谱分离

 取GB样品适量，用甲醇溶解，采用RP—HPLC／ uV法在半制备色谱柱上分离制备GB及衍生物，流 动相为甲醇一水(体积比为30：70)，流速为5．0 mL／min，检测波长为216 RE，进样量为50 L。重 复多次制备分离。根据出峰的时问，分别收集银杏内酯B及衍生物组分，合并相同组分并减压浓缩至于，用甲 醇溶解后进样分析。

 1．6 pH 值的影响

 称取GB样品506．8 mg置于50 mL容量瓶中， 用甲醇溶解，均分于5个容量瓶中，用0．1 mol／L NaOH溶液或0．1 mol／L HCI溶液调节pH 值至 4．5，5．0，8．5，9．5，1 1．0，然后分别进样，用RP— HPLC／UV分析，记录GB和衍生物的峰面积。

 1．7 温度的影响

 取银杏内酯B样品适量，放入表面皿中，散落平铺0．3 CE厚，置于烘箱中于105℃ 下分别干燥2 h，4 h，12 h，75 h，5 d，l0 d，分别用甲醇溶解后进样进行RP— HPLC／UV分析，记录GB和衍生物的峰面积。

 1．8 聚乙二醇(PEG)的影响

 按文献[12]的做法：取GB样品适量，置于容器 中，加入PEG，水浴加热，超声振荡，直至GB完全溶 解，在50℃ 水浴中分别加热2，4，9，15，24 h及在 120℃水浴中分别加热1，4，25 h，分别用甲醇溶解 后进样进行RP—HPLC／UV分析，记录银杏内酯B和衍生物 的峰面积。

 2 ．结果与讨论

 2．1 GB与衍生物的色谱关系

 RP—HPLC／UV分析显示，GB峰的保留时问为 15．198 min，除GB峰外，还有一个衍生物，其出峰 时间为44．233 min，大约是GB保留时问的3倍；按 峰面积归一法计算，两峰相对峰面积的比例为 82．37％ ／17．63％；以GB对照品为标准，按外标法定 量，GB 样品中GB 的含量为98．5％ (见图1)。 HPLC—R1分析显示，当进样浓度较低时，色谱图中 只有GB单峰；当进样质量浓度大于10 g／L时，可 见到衍生物的峰，其出峰时问也为GB的3倍左右。 以GB对照品为标准，按外标法定量，GB 样品中银杏内酯B的含量为99．1％。

 由于采用的是反相色谱柱，因而从出峰的顺序 可知衍生物的极性比GB要小；衍生物对RI的响应 值小，对uV的响应值大。

 根据色谱结果可以看出，GB和衍生物两个组 分的色谱行为差异较大，利用“1．5”节方法对两峰 分别进行收集，理论上讲应该可以将两组分完全分 开。然而对分离出的GB组分再进行分离，其中仍 含有衍生物；对分离出的衍生物组分进行分离，其中 也含有银杏内酯B。这说明GB和衍生物之问存在着相互 转化的关系。

 2．2 紫外光谱分析

 从图2可以看出，GB衍生物的最大紫外吸收 波长为212．1 RE，GB 的最大紫外吸收波长为 216．8 RE，两者相差4．7 RE。经计算GB的最大吸 光值为298，而衍生物的最大吸光值为2．29×l0 ， 大约是GB的100倍，这说明衍生物分子中存在仃 一仃 电子跃迁，表明结构中存在共轭双键；而银杏内酯B分子有 一仃 电子跃迁，表明结构中有双键，但不 是共轭双键。

 2．3 LC．MS分析

 从图3～5和表1可看出，正离子模式下GB的 分子离子峰为m／z 447．1(M+Na) ，其二聚体峰为 m／z 871．3(2M+Na) ；负离子模式下GB的分子离 子峰为m／z 423．2(M —H)一，其二聚体峰为m／z847．4(2M —H)一，二聚体失去F环产生m／z 537．2 (2M —F环)及m／z l13．0(F环)的碎片峰。这些信 息符合银杏内酯B的结构，与文献[3]报道的结果相同。

 从图6～8和表1可看出， 离子模式下GB衍 生物的分子离子峰为m／z 429．1(M +Na) ，其二 聚体峰为m／z 835．3(2M +Na) ；负离子模式下 GB衍生物的分子离子峰为m／z 405．2(M —H) 其二聚体峰为m／z 81 1．4(2M —H)一，其二聚体失 去F环产生m／z 5】9．2(2M —F环)一及m／z 1 13．0 (F环)的碎片峰。GB与其衍牛物的质谱裂解规律很相似，不同之处在于两者的相对分子质量相差 18。由此可以说明，两者的结构较为相似，衍生物可 能是GB失水后形成的。衍生物在上E离子模式下还 发现有m／z 447．1(GB+Na) 的碎片峰，说明衍生 物巾有GB；同样GB在正离子模式下发现有m／z 429．2(GB衍生物+Na) 的碎片峰，说明银杏内酯B中有 衍生物。这表明两者在特定条件下可相互转化。

 2．4 结构分析

 GB的结构见图9，属于二萜内酯类化合物，包 括1个四氢呋喃环、3个 一内酯环和由2个五碳环 连接在1个碳原子上形成的螺[4，4]壬烷系统，共6 个五碳环与叔丁基、甲基结合的独特的C20笼蔽分 子。顺式稠合的五元环F、A、D、C，以特定方式折 叠，形成一个大小恰当的半球形腔(0．4 rim(宽)x 0．5 rim(深))，该腔能接受大多数离子(Fe“ 、Ca“ 等)或某些小分子化合物(H，O等)。腔的两个平行 边被F环和C环的C1 1、C15内酯环所限定，四氢呋 喃环占据“笼”的中心位置，另外还有一个由五元环 D、E、B组成的扇贝形空腔，腔的边缘由叔丁基引导 有机弱极性分子选择性进入，半球形空腔内含有一 定数量的羟基。其余的环以稠合的方式连接，其中 的一个五元环上连接有一个天然产物中罕见的叔丁 基，银杏内酯B分子中含有C1、C2、C3、C7、C8、C10和C14 等7个手性碳原子，这些手性碳原子的构型决定了 GB的刚性笼状结构及其相对的稳定性和特殊的生 物活性 。GB和衍生物之间相差一个水分子，而 GB进行消除反应的条件是一OH 的周围要有活泼 H。从GB的结构上看，C10位的一OH不可能发生 消除反应；只有C1位的一OH和C3位的一OH可以 发生消除反应，而C1位的一OH 和C2位的一H 即 使形成双键，也不具备共轭条件；C3位的一OH 和 C2位的一H也是如此；只有C3位的一OH和C14位 的一H脱水后才能形成共轭双键结构。C14位的 ～ H受一CH 供电子的影响，电子云较多，约束力 小，易于和C3位的一OH进行消除反应。

 2．5 温度对衍生物的影响

 从表2可知，在105℃下对GB进行加热，实验 结果是随着加热时间的延长，GB与衍生物相对峰 面积比逐渐增大，这表明加热时间越长越有利于衍 生物转化为银杏内酯B；也说明GB对热相对稳定，而衍生 物对热相对不稳定。

 2．6 pH值对GB和衍生物的影响

 从表3可知，pH对GB和衍生物的关系影响不 大。当pH大于8．5时，两者的峰面积都下降很快； pH为9．5时，衍生物的峰消失，而GB的峰面积也下降很大，其原因是内酯环在碱性条件下易于开环。 从峰面积的变化看，衍生物的开环速度比银杏内酯B快。 由此可以说明，两者具有相似的结构，分子中均有内 酯结构。

 2．7 溶剂和温度对GB和衍生物的影响

 溶剂和温度的综合作用对GB和衍生物的影响 更加显著。从表4和表5可以看出，在50℃下随着 加热时间的延长，GB与衍生物的相对峰面积比逐 渐增大，加热l5 h时，衍生物全部转化为GB；在 120℃下加热4 h，衍生物峰全部消失，但在1．2～3．0 rain处有小峰出现。究其原因可能是由于PEG 分子中的一OH 与GB 中的一OH有较强的氢键结 合，对GB有封闭和保护作用，使GB 的稳定性增 强。与此相反，衍生物分子中的一OH数量相对较 少，PEG对它的保护作用较小，加之衍生物本身不 太稳定，很容易转化为银杏内酯B。

 3 小结

 (1)GB在特定条件下能脱去一个水分子形成 一种衍生物，两者共存且相互转化。

 (2)UV光谱显示，衍生物在212．1 RE 有较大 的吸收，其最大吸光度大约是GB的100倍，为2．29 ×l0 ，这是衍生物中存在7r一7r 电子跃迁的结果， 显示其结构中有共轭双键存在。

 (3)LC—MS显示，衍生物的相对分子质量为 406．2，与银杏内酯B的相对分子质量相差18，为一个水分 子。两者的uV光谱吸收带和质谱裂解规律相似， 在碱性条件下均易于开环，说明两者的结构相似。

 (4)温度越高，加热时间越长，越有利于衍生物 转化为GB；相反温度越低，越有利于衍生物的存 在，说明了衍生物稳定性比GB差。

 (5)溶剂和温度的综合作用对银杏内酯B和衍生物的 影响更加显著。溶剂PEG 可能和GB中C3位的 一OH(裸露较多)形成氢键，有保护作用，抑制了 一OH的活性，使GB变得更加稳定。相反，衍生物 中此位没有一OH‘，不具有保护作用，因而受温度影 响更大。