关键词:银杏内酯B 神经干细胞 细胞分化 神经突起生长 细胞因子信号转导抑制因子-2

 Ginkgolide B Promoting Neurite Outgrouth of Differentiated in Vitro

 Abstract:Objective： To observe the effect of Ginkgolide B （GKB） on neurite outgrouth of neural stem cells （NSCs） differentiated in vitro and to preliminarily explore its possible mechanism. Methods： NSCs were cultured by using GKB differentiation medium containing different concentrations （20 mg/L, 40 mg/L, and 60 mg/L）. The numbers and lengths of neurite were measured at different time points. Immunofluorescent staining was used to detect the expression of suppressors of cytokine signaling-2 （SOCS2） on day 7. Results： （1） the numbers and lengths of neurite in all the GKB groups at 24 hours and day 3 were significantly more and longer than those in the control group （P 〈0.01 ）; the numbers and average length of neurite in the 40 mg/L and 60 mg/L GKB groups were significantly more and longer than those in the 20 mg/L GKB group （P 〈 0.01 ）, but there were no significant differences between them. （2） The lengths of neurite at day 3 in all the GKB and control groups were significantly longer than those at 24 hours （P 〈0.01）; there were no significant differences between the numbers of neurite at day 3 and at 24 hours in the control group （P 〉 0.05）, while the NCS average number of neurite between the same GKB groups was significantly increased （P 〈 0.01 ）. （3） The average absorbency of SOCS2 immunoreactive products in all the GKB groups were 1. 382, 1. 578, and 1. 527 respectively, and they were all significantly higher than that in the control group （1.134, P 〈 0.01 ）; the average absorbency of SOCS2 immunoreactive products in 40 mg/L and 60 mg/L GKB groups was significantly higher than that in the 20 mg/L GKB group （P 〈 0. 01 ）, however, there were no significant differences between 40 mg/L and 60 mg GKB groups. Conclusions： GKB promotes neurite outgrowth of NSCs differentiated in vitro by increasing the numbers and lengths of neurite. Its mechanism of action may be associated with the upregulation of SOCS2 expression.

 Key words:ginkgolide B; neural stem cell; cell differentiation; neurite outgrowth; suppressors of cytokine signaling-2

 中枢神经系统疾病和损伤的共同病理学特点是 神经元脱失和神经网络结构受到破坏，导致神经功 能缺损，晚期治疗和功能恢复是康复医学的热点和 难点。神经干细胞(neural stem cell，NSC)移植治疗 中枢神经系统疾病和损伤可达到修复神经通路和重 建神经功能的目的，为临床实践带来了希望。

 功能康复必须以结构重建为基础，替代脱失的 神经元，促进神经突起生长，修复受损神经网络结 构。神经突起生长受各种信号机制的调节，包括生 长因子介导的一系列信号转导通路。细胞因子的效 应又受多种因子调节，如细胞因子信号转导抑制因 子一2(suppressors of cytokine signaling一2，SOCS2)。后 者是一种潜在的神经分化调控因子，能促进NSC向 神经元方向分化，促进神经突起生长u』。

 一些研究表明，银杏叶提取物能促进周围神经 再生和功能恢复 。以往有关银杏叶提取物促进 神经再生的实验研究多以外周神经为研究对象，但 银杏内酯B(Ginkgolide B，GKB)能否促进体外分化 的NSC的神经突起生长，其可能的作用机制是什 么，均未见相关文献报道。因此，本实验通过探讨不 同浓度GKB对NSC分化的神经突起生长的影响及 其机制，旨在为GKB应用于神经系统疾病和损伤提 供一定的理论基础。

 1 材料和方法

 1．1 NSC分离和培养

 清洁级SD大鼠El4．5～16．5孕鼠(第三军医 大学野战外科研究所动物实验中心，动物合格证号： 2002-008)，麻醉后取胎鼠，解剖显微镜下取侧脑室 室管膜前下区(anterior sub~ntricular zone，SVZa)组 织。参照蔡文琴等 的NSC培养和纯化方法，机械 研碎SVZa组织，300目筛网过滤成单细胞悬液，加 入含碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblagro~h factor，bFGF)(Sigma公司，浓度20 )和 B27(Gibco公司，浓度20 metE)的DMEM／F12 (Hyclone公司)无血清培养基，细胞计数，以I× 10。／mL细胞密度移人培养瓶，置于饱和湿度、37℃ 、 5％ c02孵箱中培养。24 h后换液1次，换出死细胞 和其他杂质。以后每3～4 d传代1次：收集培养瓶 中细胞悬液于离心管，1000转／min离心5 min，弃上 清，加入适量新鲜细胞培养液，吸管轻轻吹打，将大 的神经球分散为单细胞悬液，加入适量细胞培养液， 以适中的细胞密度分装后转入孵箱内进行传代培 养，增殖、纯化NSC。

 1．2 NSC分化和实验分组

 培养的第2～3代神经球离心，以约2×10s／cm2 细胞密度接种于预先经100 mg／L多聚赖氨酸处理 的2块12孔培养板各孔中的盖玻片上。每块培养 板分为对照组以及20 mg／L、40 mgm 和60 mgm GKB组。对照组培养基用Dl ’M 12，另加5％ 胎 牛血清配制。GKB组分化培养基为在对照组培养 基的基础上加入20 mgm、40 mg／L和60 mg／L GKB (购自DELTA天然有机化合物信息中心)。将培养 板置于饱和湿度、37℃ 、5％ C()’培养箱培养，每隔 3 d置换培养液1次。

 1．3 免疫荧光染色和图像分析

 培养24 h、3 d和7 d后，倒置相差显微镜下观 察各时间点细胞生长情况，随机抽样，用SPOT Advance软件测量各组细胞突起数量和长度(24 h、 3 d)。7 d后取出盖玻片，用Zamboni固定液固定细 胞备用。各实验组行免疫荧光细胞化学染色，检测 SOCS2表达。各组均设阴性对照，阴性对照不加一 抗，其余步骤相同。操作步骤：取出盖玻片经 0．01 mrnol／L PBS漂洗5 min×3次；滴加正常封闭 用血清，孵育40 rain；用滤纸吸去多余血清，滴加一抗兔抗SOCS2抗体(Santa公司，工作浓度为1：200)， 37cI=下放置2 h，然后置入4 c【=冰箱过夜；漂洗后滴 加荧光二抗羊抗兔TR／TIC(Jackson Irnrnunoresearch 公司，工作浓度为1：100)，室温下放置2～4 h；漂洗 后以50％甘油／DAPI液封片；Olympus荧光显微镜下 观察并摄影。每张盖玻片随机取5个视野，用 Image-pro Plus分析软件系统测量SOCS2阳性细胞 免疫反应产物的吸光度，计算平均吸光度纳入统计 分析。

 表1 不同浓度GKB对NSC神经突起 数量和长度的影响(n=3)

 与对照组比较，P<0．叭；与20 L GKB组比较，tP<0．叭 {P<0．05；与24 h相同GKB组比较，§P<0．叭

 1．4 统计学方法

 采用SPSS 13．0软件包进行统计学处理，计量 资料以元±s表示，进行单因素方差分析(One-way ANOVA)和配对z检验。P<0．05为有显著性差异。

 2 结果

 2．I GKB对NSC神经突起数量和长度的影响

 神经球贴壁后(12 h)，细胞开始向周围迁移并 长出小的芽胞。24 h后，更多的细胞由神经球迁移 出来，芽胞形状改变为轴突和树突形状，有分支，并 不断向周围延伸(图1A～1D)。分化3 d后，突起继 续生长和延长(图1E～1H)。

 结合本实验室以前的实验资料统计分析，各 GKB组NSC在同一时间点(24 h、3 d)的神经突起 平均长度显著长于对照组(P<0．01)；40 medL和 60 medL GKB组NSC的神经突起平均长度显著长 于20 mg／L GKB组(P<0．01)，但两者之间无显著 差异。不同时间点组间比较发现，各GKB组和对照 组3 d时NSC神经突起均较24 h时显著增长(P< 0．01)。

 图1 GKB对NSC分化各时间点神经突起生长的影响 (×200)

 A：24 h对照组；B：24 h 20哪 GKB组；C：24 h 40 mg／I．GKB组；D：24 h 60 mgCt．GKB组；E：3 d对照组；F：3d 20 mgCt．GKB组：G：3 d 40 medLGKB组；H：3 d 60 meiLGKB组

 图2 NSC分化7 d后SOCS2表达的变化 (免疫荧光染色，x400)

 A：对照组；B：20 mg／LGKB组；C：40 meiLGKB组；D：60 meiLGKB组

 另外，各GKB组同一时间点(24 h、3 d)神经突 起数量较对照组显著增加(P<0．01)，除40 mg／L GKB组与60 mg门L GKB组间无显著差异外，各GKB 组间比较均有显著差异。不同时间点组间比较表 明，对照组3 d时神经突起数量较24 h时有所增加， 但无统计学差异，而相同GKB组3 d时神经突起数 量均较24 h时显著增多(P<0．01)(表1)。

 2．2 GKB对NSC SOCS2表达的影响

 分化7 d后的免疫荧光染色分析显示，SOCS2 表达定位于胞质内，对照组仅有少量SOCS2蛋白表 达，GKB组SOCS2表达增加，SOCS2阳性细胞显著 增多(图2)。20 m{ 、40 mg门L和60 mg／L GKB组 sOcs2免疫反应物平均吸光度分别为1．382 4- 0．076、1．578±0．087和1．527±0．080，与对照组 (1．134±0．063)存在显著差异(P<0．01)。 40 mg／L和60 mg门L GKB组SOCS2免疫反应物平均 吸光度显著高于20 mg／L GKB组(P<0．01)，但 40吨 GKB组与60 mg门L GKB组无显著差异。

 3 讨论

 研究表明，银杏内酯在促进胚胎基底前脑胆碱 能神经元的生长发育方面具有类似于神经生长因子 和脑源性神经营养因子的作用 。银杏内酯还能 促进多巴胺能神经元发育，同时能使TH阳性神经 元胞体增大和突起延长 。张烽等 发现，银杏叶 提取物可促进大鼠坐骨神经再生。

 在本实验中，我们从SD大鼠胎鼠SVZa成功分 离培养NSC并使其分化。NSC在增殖培养基中悬 浮生长，处于增殖状态，当撤去促进增殖的因素，如 B27和bFGF后，神经球迅速贴壁并开始分化。在本 实验中，不同组别NSC贴壁速度、突起生长速度、突 起数量和长度均存在显著差异。结合本实验室以往 实验资料 分析，20 rng门L、40 mg／L和60 mg／L GKB 组在相同时间点(24 h或3 d)神经突起长度和数量 与对照组均存在显著差异(P<0．01)；40 n1g 和 60啤r几GKB组神经突起数量和平均长度与 20啤江GKB组比较有显著差异(P<0．01)，但 40 mg／L GKB组与60 mg／L GKB组无显著差异。相 同组间不同时间点的比较(24 h和3 d)表明，各 GKB组和对照组3 d时突起长度较24 h时显著增 长(P<0．01)；对照组3 d时神经突起数量较24 h 时有所增加，但无显著差异，而相同GKB组3d时神经突起数量较24 h时显著增多(P<0．01)。这提 示，GKB能促进NSC神经突起生长，增加突起数量 和长度，其最佳浓度为40 mg门L，且随着分化时间的 延长效应更加明显。

 神经突起萌芽和延伸是神经元之间相互连接以 及发挥功能的物质基础，首先出现小的芽胞，而后逐 渐形成突起，最后突起转变为轴突和树突。神经突 起生长受多种因素调控，包括正向调控因子、负向调 控因子和细胞外信号转导分子 。促进神经突起 生长的因子包括各种生长因子、神经营养因子、神经 突起生长因子等；抑制神经突起生长的因子包括髓 鞘抑制蛋白、Nogo、髓鞘相关糖蛋白等。此外，神经 突起的生长还受各种信号转导机制的调节，包括生 长因子介导的一系列信号转导通路。研究发现， SOCS家族蛋白可能参与了此过程¨。

 SOCS2是SOCS家族成员之一，最初发现 SOCS2是GH信号的负性调节因子⋯J。然而， SOCS2也能通过与GH信号无关的通路调节表皮生 长因子受体(epidemal growth factor receptor，EGFR) 磷酸化，中枢神经系统和PC12细胞过度表达 SOCS2可使神经突起增长，而添加EGFR抑制因子 则能阻断SOCS2介导的促神经突起增长效应_1 ， 其机制是过度表达的SOCS2与EGFR结合导致 EGFR~续磷酸化，从而促进神经突起生长。SOCS2 在促进NSC向神经元方向分化的同时，以不依赖生 长激素(growth hormone，GH)信号的方式促进神经 突起生长和突起数量增加_l 。GKB能促进神经突 起生长，表现为神经突起数量增多和突起长度增长； GKB组SOCS2阳性细胞百分比、SOCS2免疫反应物 平均吸光度均显著高于对照组，提示GKB能上调分 化细胞SOCS2蛋白表达。SOCS2表达上调，一方面 可抑制JAK／STAT信号转导途径，阻断GH信号，另 一方面能通过与EGFR结合导致EGFR持续磷酸 化，从而促进NSC向神经元分化和突起生长。

 综上所述，本研究观察到GKB促进体外分化的 NSC的神经突起生长，表现为神经突起数量增加和 突起长度增长，同时上调SOCS2表达。成熟的细胞 形态结构表明细胞可能具有更为复杂和完善的功 能，为下一步研究奠定了一定的基础，但分化的神经 细胞和神经突起是否具有完整的生理特性和功能， 有待体内和体外电镜、细胞生物学和功能学研究来 确定。