材料与方法

 1．实验动物及试剂

 雄性SD大鼠，体重200—250 g，由华中科技大 学同济医学院实验动物中心提供；银杏内酯B购于 美国RBI公司，溶解于0．1％ 的DMSO溶液；兔抗 Fos蛋白一抗购于北京中山生物技术公司。

 2．鞘内置管

 大鼠腹腔注射10％水合氯醛(300 mg／kg)麻醉 后，参考Milligan 5 等的方法，去掉 椎板暴露硬脊 膜，用针尖挑破脊膜，将一端封闭的充满生理盐水的 PE．10导管向头端插入3 cm，固定导管并逐层缝合 切口，导管外端经皮下隧道至后颈部出皮肤后固定， 热熔封口，术后分笼饲养，室温维持20～25℃ ，自然 照明，自由饮水和摄食。大鼠清醒24h后经导管注 射2％利多卡因10 l判断导管位置，如注射后30s 内大鼠出现双后肢麻痹现象说明导管位置正确。

 3．神经痛模型的建立及分组

 取导管位置正确并且无运动功能障碍的大鼠 24只纳入实验，随机等分为4组，假手术组(sham 组)，SNI组，SNI+DMSO(二甲基亚砜，5 1)对照组 和SNI+BN52021(10o g／5 1)治疗组。鞘内置管 3天后，参照Dec0sterd和woolf 的方法建立SNI 疼痛模型：10％水合氯醛(300m kg)麻醉后，于大 鼠右侧大腿中部切开，暴露游离坐骨神经分支，分别 切断并结扎胫神经和腓总神经，保留腓肠神经；假手 术组仅暴露游离坐骨神经分支，不作切断和结扎。

 4．痛阈测定

 建立模型手术的前1d测基础痛阈，手术后1， 3，5，7，l0和14d鞘内给药一次，30min后测痛阈。 参照Obata 等的方法，采用电子自动爪触觉测试 仪(Ug0 Basile，Comerio，Italy)，测机械缩爪阈值 (paw withdI．awal mechanical threshold，PWMT)；参照 Hargreaves 等的方法，采用辐射热测痛仪(BME一 410A型，中国医学科学院生物医学工程研究所)，测 辐射热缩爪潜伏期(paw withdrawaltherrnal latency， PWTL)。

 5．免疫组织化学

 第14d测痛阈后，大鼠腹腔注射l0％水合氯醛 (300 m kg)麻醉下行主动脉内插管灌注，生理盐 水200m 陕速冲洗，继之以预冷的4％多聚甲醛溶 液(内含O．1 m0l／，L PBS，pH 7．4)500 ml灌注固定。取脊髓L4～L6节段，再固定24h后，置于25％蔗糖 液4℃冰箱保存过夜。次日，取脊髓冰冻切片，切片 厚度25 m。切片人0．Ol m0l／，L PBS液中漂洗后，0． 25％ ton X—l00孵育30 min，3％双氧水(H202)室 温20 min，30％正常羊血清中37cc封闭40 min后， 加入1：300倍稀释的兔抗Fos蛋白一抗，37℃孵育 1h，4℃ 冰箱过夜；次日PBS清洗后，加入1：100倍 稀释的生物素化羊抗兔IgG二抗，37℃ 湿盒中孵育 30 min；PBS清洗，加入1：100倍稀释的ABc复合 物37℃孵育45min；PBS清洗，DAB显色5 n，流水 冲洗，终止反应；裱片、晾干，梯度酒精脱水，二甲苯 透明，中性树胶封片。每只大鼠随机选取5张切片， Mkon显微镜下观察并摄片，对各部的FLI(F0s—like immunoreactivity)阳性神经元计数。

 6．统计分析

 所有数据以均数±标准差(x±S)表示，采用 SPsS l1．0统计软件包进行单因素方差分析，P<0． 05为差异有统计学意义。

 结 果

 鞘内注射银杏内酯B对大鼠SNI所致痛敏的 影响：假手术组大鼠术前与术后PWMT未见明显变 化，SNI组和DMSO组大鼠于神经损伤后1d出现机 械异常痛敏(mechanical al1odynia)，至第7d时达到 高峰并在观察时间内维持稳定，鞘内注射银杏内酯B明显减轻SNI所致的机械性异常痛敏(见图1)， 各组大鼠辐射热缩爪潜伏期PWTL无明显差异。

 鞘内注射银杏内酯B对sNI引起的背角内cf0s 表达的影响：SNI引起同侧脊髓背角内FLI阳性 神经元增加，对侧背角内仅有少量FLI阳性神经元， 鞘内应用银杏内酯B后大鼠脊髓背角内c—f0s表达水平与SNI组及DMSO对照组相比明显降低(P< 0．05)，见图2、图3、图4和图5；各组大鼠脊髓Fu 阳性神经元计数(见附表)。

 讨 论

 SNI模型是一种新型神经病理痛动物模型，具有 手术创伤小、操作简单及模型稳定可靠的优点，是研 究慢性神经痛的理想动物模型。本研究成功地建立了sNI模型，手术后1d同侧后爪即出现机械异常痛 敏，术后7d达到高峰，随后趋于稳定；研究结果显 示，sNl模型的神经损伤对大鼠辐射热潜伏期没有明 显影响，符合该模型特点。

 c．f0s基因是真核细胞内的即刻早期基因，其表达产物F0s蛋白是机体受伤害性刺激的一个标志； 伤害性刺激后，Fos蛋白在脊髓和延髓的背角神经元 内很快的表达，F0s免疫阳性细胞数目由刺激的强度 和形式决定。因此，Fos蛋白的表达可作为中枢神经 系统伤害性神经元活动的标志 J。同样，许多抗伤 害性作用，可通过减少伤害性刺激后Fos蛋白的表 达来评价。本研究右侧SNI引起同侧脊髓背角神经 元c—f0s的表达增强，FLI阳性神经元主要集中于I． Ⅱ层，Ⅲ-V层数量较少，鞘内注射银杏内酯B明显 减少各层FLI阳性神经元的数量，和行为学表现一 致。

 PAF是一种内源性磷脂类介质，通过与其受体 结合产生细胞效应，目前研究认为存在一个突触膜 结合位点和二个细胞内结合位点 J。PAF突触膜位 点是一类G蛋白偶联受体，激活后调节多个细胞内 信号转导级联反应⋯ ，促进谷氨酸释放，调节N．甲 基-D一天(门)冬氨酸(NMDA)的活性和NMDA受体 电流¨ 。PAF与微粒体位点结合诱导神经元和胶 质细胞内某些基因如COX-2、TNF．仪、IL．1B和IL一6 的表达¨卜乃J。银杏内酯B是PAF受体的非竞争性 拮抗剂，对细胞内外结合位点均产生作用，但对细胞 膜表面位点结合力强 ]。本研究鞘内注射银杏内酯 B明显减轻SNI大鼠机械性异常痛敏，但对辐射热 缩爪潜伏期无明显影响，其镇痛机制可能是作用于 PAF受体，在脊髓水平调节痛觉信号的传导。

 研究结果提示，鞘内注射银杏内酯B明显改善 SNI诱发的大鼠机械性异常痛敏，但对热痛敏无影 响。sNI引起脊髓Fos蛋白的表达增强，鞘内注射银杏内酯B能够减弱这一变化，并与大鼠痛行为改善 相一致。