1 材料与方法

 1．1 实验材料膜片钳装置(Tektronix一5111A．日 本)，记录液，自制玻璃微电极。

 1．2 实验方法取扩增5～10代的大鼠骨髓MSCs， 40 mg／L银杏内酯B诱导1周后的细胞爬片 ，显微 镜下观察选取表面光滑，胞体呈锥形，具有长突起的神 经元样细胞，用膜片钳全细胞记录方式检测细胞内外 的离子通道电流，步阶刺激从一70 mV到+60 mv，步 阶每10 mV记录1次。记录液主要是电极内液和细胞外液。电极内液的组成为(mmol／L)：KC1 140，HEPES 10，EGTA 10，调pH至7．2～7．4。细胞外液的成分是 (mmol／L)：NaC1 140，KC1 5，MgC1，1，HEPES 10，Glu— eose 10，CaC1：3，调pH为7．2～7．4。如需要阻断钠 电流，可在细胞外液中加入河豚毒素(TTX)1~mol／L。

 2 结果

 结果见图1～3。图1(a)一(f)分别为6例神经元 样细胞的全细胞电流记录图，从一70 mV到+60 mV，除可见钾电流I 外，图1(e)K 电流I 并不完 全呈直线上升，而是向纵轴方向有弯曲，形成外向整 流I 。图1(g)是全细胞记录的模式分析图。图2为 标准对照，为培养的新生大鼠神经元用步阶刺激记 录的全细胞电流，可见I ，I ，I ，步阶刺激从 一70 mV~1]+30 mV，步阶10 mV。证明银杏内酯B诱导后的MSCs记录的电流类似于神经元。图3为 诱导后细胞的钾电流的I—V曲线，由图可见钾电流 缓慢激活。

 3 讨论

 膜片钳技术是在电压钳技术的基础上发展起来 的，首先出现于20世纪80年代，为细胞水平和分子水 平研究离子通道的功能开辟了新的途径 ]。具有 lpA的电流灵敏度、1 m的空间分辨率和10 s的时 间分辨率。膜片钳技术记录细胞膜的电活动有4种基 本方式：细胞贴附式，外膜向外式，内膜向外式和全细胞记录。前三种方式总称为单通道记录，反映的是细 胞膜上一个或几个离子通道的电活动变化，而全细胞 记录反映的是整个细胞膜上所有离子通道电活动变化 的总和。膜片钳技术可以在整体动物、组织片、急性分 散的细胞和体外培养的细胞(肌细胞、神经元、内分泌 细胞、血细胞等)等标本上实施。其中，体外培养的细 胞有清洁的膜表面，细胞种类较为单一，容易辨认和定 位，可在高倍显微镜下操作，这有利于玻璃电极与细胞 膜之间形成高阻封接，适于膜片钳技术来检测。有实 验证实来自胚胎大鼠视网膜的干细胞在体外培养后可 记录到全细胞外向整流钾电流和电压依赖钠电流 。 本实验即应用膜片钳技术研究由MSCs分化而成的神 经元样细胞的全细胞电流。

 细胞内外的离子浓度差是可兴奋细胞的基本特 征。细胞兴奋时，电压门控性离子通道开放，内向的 Na 电流和外向的K 电流是促使细胞膜去极化和复 极化的基本电流。在电压钳状态下形成全细胞记录 后，将细胞膜电位钳制在一70 mV，给予一系列步阶为 10mV去极化的脉冲刺激，可激活电压门控性钠、钾、钙离子通道，记录到它们的离子电流，其中ca 电流 因幅值小并易失活，被淹没在K 电流中。

 本实验通过膜片钳技术检测了MSCs在银杏内酯B诱导后的离子通道电流。细胞膜钳制在一70 mV，去 极化步阶脉冲幅度为10 mV，去极化最大幅度为 60 mV。共记录了6例细胞，均能记录到钾通道电流， 而且钾通道电流大多具有激活缓慢的特点；另外，诱导 后的神经细胞还具有外向整流特点，这些与神经元具 有的延迟整流性钾通道电流相似。但在6例细胞上钠 通道电流不明显。这可能与细胞所处的微环境与脑内 微环境不同，不能开启电压门控性钠离子通道。也可 能是由于来自成体骨髓的问充质干细胞已经发生部分 分化，无法完全转分化成成熟的神经元。离子通道的 开启受多种因素影响，其中细胞所处的微环境起着很 重要的作用。另外，体外诱导体系虽然能够诱导一些 干细胞发生横向或纵向分化，但并不能完全模仿体内 微环境，生物体自身的一些时序性调控和功能性调控 模式是复杂的过程。不过，本实验也证实银杏内酯B诱导的MSCs，不仅具有神经细胞的外形和免疫学特 征 ，而且具有神经元的基本电生理功能，为13后的干 细胞移植治疗神经系统疾病提供了实验基础。