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| 淫羊藿苷（ICA）对化疗后免疫抑制小鼠的免疫促进作用 |
化疗已成为肿瘤治疗最重用的手段之一，但化
疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时也能杀伤正常组织和
细胞，尤其破坏了免疫系统，损害了患者的自身抗肿
瘤功能。因此，寻找减轻化疗引起的免疫功能抑制状态的药物，提高治疗效果，是化疗过程中迫切需要
解决的问题。淫羊藿为补益类中药，具有温肾壮阳，
强筋骨，祛风湿的功能。体内外研究发现，淫羊藿的
主要单体成分淫羊藿苷(Icariin，淫羊藿苷)具有良好的抗
肿瘤和免疫调节活性ll 4。，但淫羊藿苷能否作为肿瘤化疗
的辅助药物，减轻化疗引起的免疫抑制，增强机体的
免疫功能，尚不十分清楚。本研究利用环磷酰胺
(Cyclophosphamide，Cy)构建化疗后免疫抑制小鼠，系
统地观察和探讨淫羊藿苷对免疫低下小鼠免疫功能
的影响，为淫羊藿苷的开发应用提供新的实验基础。
1 材料与方法
1．1 动物和材料C57BL／6j近交系小鼠，SPF级，
购自北京大学医学部实验动物科学部，京医动字第
0131944号，动物使用许可证号：SYXK(冀)2008．
0051；Cy购自江苏恒瑞医药股份有限公司，生产批
号：08021821；参芪扶正注射液(Shenqi)购自丽珠集
团利民制药厂，生产批号：219990065；淫羊藿苷，纯度98％ 以上；细菌脂
多糖(Lipopolysaccharide，LPS)和刀豆蛋白A(Con—
canavalin A，ConA)均购自Sotarbic公司，批号分别为：
L8880、C8110；FITC标记的抗CD3单克隆抗体为美
国Invitrogen公司产品(HM3401)；PE标记的NK1．1
单克隆抗体为美国Cahag公司产品(LMM6604)；乳
酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒购自南京建成生物工程
有限公司，产品批号：20090219；TNF—a ELISA检测试
剂盒购自美国ADL公司，生产批号：10—5053；结肠癌
细胞Colon26由本室保存；淋巴细胞分离液购自中国
医学科学院生物工程研究所。
1．2 方法
1．2．1 实验分组和给药方法l J C57BL／6i小鼠60
只，雌雄各半，7～8周龄，平均体重16～20克，动物
房内适应环境一周后随机分组，每组l0只，除正常
对照组外，实验组、阳性对照组和模型对照组均给予
一次腹腔注射Cy，300 mg／kg。小鼠模型建立后第二
天，实验组小鼠通过灌胃方式给予不同剂量淫羊藿苷
[150、80、40 mr,／(kg-d)]，阳性对照组小鼠经静脉注
射参芪扶正注射液_6J，1 ml／d。模型对照组小鼠给
予等量生理盐水(Ns)。连续给药10天。末次给药
12小时后折颈处死小鼠，称量体重，无菌分离脾脏、
胸腺，称重，计算胸腺指数('17)和脾脏指数(SI)，公
式如下：TI：胸腺重( )／体重(g)，SI：脾脏重(rng)／体重(g)。
1．2．2 细胞悬液的制备和计数 自小鼠眼眶静脉
丛取外周静脉血1 ml，密度梯度离心法分离外周血
淋巴细胞(PBMC)，悬浮于0．5 ml无血清培养基，光
镜下计数；无菌取小鼠脾脏，常规研磨制备单细胞悬
液，密度梯度离心法分离脾淋巴细胞(Splenic lym—
phocyte，SPL)，悬浮于4 rnl无血清培养基中，光镜下
计数，备用。
1．2．3 脾淋巴细胞的增殖反应l7j 取方法1．2．2
中分离的脾淋巴细胞，经贴壁处理后取悬浮细胞，
2％台盼蓝试验证实细胞存活率>95％，离心后用含
10％胎牛血清的RPMI1640培养基调整浓度为2 X
106个／ml，加入96孔培养板，每孔180 l，分别加入
ConA或LPs(终浓度分别为10和40 ug／n~)，置于饱和湿度、37~C、5％C02培养箱中培养48小时，培养
结束后收集培养上清100 l，备用。然后每孔加入
MTT(5 mg／m1)20 ，继续常规培养4小时，离心弃去
上清，每孔加入DMSO 150 F1，以测定波长540 nnl、参
考波长620 nm检测各孔吸光度(A)值，计算每组淋
巴细胞增殖率。增殖率(％)：[实验组／(实验组一对照组)]×
100％ 。
1．2．4 脾NK细胞杀伤活性检测_8，9J 取方法
1．2．2中获得的脾淋巴细胞接种于直径为6 cm的培
养皿，培养2小时，收集未贴壁细胞，调整细胞浓度
至2×106个／ml，备用。取对数生长期小鼠结肠癌
细胞Colon26作为靶细胞，调整细胞浓度为1×105
个／ml，备用。每孔加入100 效应细胞，再加入100
l靶细胞，效应细胞／靶细胞(E／T)比例为20：1，每
孔加入ConA 10 (终浓度为5 ug／m])，于饱和湿度、
37~C、5％co2培养箱中培养48小时。培养结束后，
取每孔培养上清液10 加入酶标板中，测定孔和测
定空白孔各5 。按照试剂盒说明书和文献[9]操
作，酶标仪450 nm波长测吸光度(A)值，另取细胞培
养上清液100 tfl备用。按下列公式计算细胞杀伤活
性：细胞杀伤活性c％ = 藿 E 藿 x100％。
1．2．5 CTL细胞活性检测取方法1．2．2中获得
的脾淋巴细胞(浓度为2 X 106 ml一)，加入24孔板
中，每孔300 ，另加100 ug／ml丝裂霉素C处理半
小时后的Colon26细胞，调整浓度为1×l0s ml～ ，每
孔100 F1，每孔另加入Co 10 (终浓度为5 r,g／
rn1)，于饱和湿度、37oC、5％CO2培养箱中共孵育72
小时，诱导出细胞毒性 细胞(CTL细胞)ElO]。、诱导
结束后将CTL细胞调整浓度为4 X 106 ml一1作为效
应细胞，取对数生长期小鼠结肠癌细胞株Colon26作
为靶细胞，调整浓度为1×105 ml～。每孔加入l00
l效应细胞，再加入l00 靶细胞，E／T为40：1，于
饱和湿度、37℃、5％C02培养箱中培养48小时，培
养结束后进行LDH杀伤实验，方法同1．2．4。
1．2．6 TNF．a分泌和测定取方法1．2．3中获得的
各组小鼠脾淋巴细胞上清液100 rtl，用ELBA试剂
盒测定TNF-(~含量，操作步骤按产品说明书进行，在
酶标测试仪上测定570 Bin处吸光度(A)值。根据标
准曲线计算出培养上清液中细胞因子的含量。
1．2．7 淫羊藿苷对脾脏细胞中T亚群的影响 取方法
1．2．2中获得的脾细胞(浓度2×106 ml )1 ml，用冷
PBS洗涤两次，加入抗CD3单克隆抗体和抗NK1．1
单克隆抗体，4℃ 避光孵育18小时，流式细胞仪
(FACS)~0定各组小鼠CD3表达阳性的细胞(T细
胞)占总细胞百分比和CD3与NK1．1同时表达阳性细胞(NKT细胞)的百分比。
1．3 统计学处理数据以 ±S表示，所有数据经
SPSS11．5统计软件包处理，各组的组间均数比较用
单因素方差分析，实验组与对照组组间均数比较用
独立样本t检验，P<0．05表示差异有统计学意义。
2 结果
2．1 淫羊藿苷对脾和胸腺指数的影响模型组小鼠脾
脏指数和胸腺指数明显低于正常对照组，说明Cv抑
制了小鼠免疫器官。淫羊藿苷各剂量均可使小鼠脾脏指
数升高，与模型对照组相比有显著性差异。淫羊藿苷高
[150 mg／(kg·d)]、低[40 rag／(kg·d)]剂量组提高了
小鼠胸腺指数，与模型对照组相比有统计学意义，但
均未达到正常组水平，见表1。
2．2 小鼠淋巴细胞计数模型对照组小鼠外周血
淋巴细胞(PBMC)和小鼠脾淋巴细胞(SPL)数量与正
常对照组相比，均显著减少；淫羊藿苷各剂量组和参芪扶
正注射液均可提高外周血淋巴细胞数量，与模型对
照组相比有显著性差异，其中淫羊藿苷高、中剂量组与正
常对照组相比已无显著性差异。淫羊藿苷各剂量处理组
均可使脾淋巴细胞数量升高，与模型对照组比较有
显著性差异，但未达到正常组水平，见表2。
2．3 小鼠脾淋巴细胞增殖反应 ConA可促进淫羊藿苷高[150 me,／(kg·d)]、中[8O mg／(kg-d)]剂量和参芪
扶正注射液处理组小鼠脾脏T淋巴细胞增殖反应
率，与模型对照组的T细胞增殖反应率相比，有显著
性差异；LPS可促进高剂量淫羊藿苷组小鼠B细胞的增
殖反应率，与模型对照组相比有显著性差异，中、低
剂量淫羊藿苷处理后对B细胞增殖反应无显著影响，说
明相对于B细胞，淫羊藿苷更好地促进了T细胞的增殖
反应。以正常对照组脾淋巴细胞增殖率为100％计
算各组小鼠淋巴细胞增殖率，见图1。
2．4 NK和CTL细胞活性模型对照组小鼠NK和
CTL细胞的杀伤活性显著降低。不同浓度淫羊藿苷均能
提高脾NK和CTL细胞的杀伤活性，与模型对照组
相比，有显著性差异；各浓度组淫羊藿苷组小鼠NK细胞
杀伤活性及淫羊藿苷高浓度组[150 mg／(kg·d)]小鼠CTL
细胞的杀伤活性与正常对照组相比，已无明显差异，
见图2
2．5 小鼠脾淋巴细胞TNF．a的产生 与正常组小
鼠比较，模型组小鼠脾单个核细胞产生的TNF．a含
量显著减少，说明Cv抑制了小鼠脾细胞TNF．a的产
生。参芪扶正注射液和淫羊藿苷高、中剂量均能提高小
鼠脾单个核细胞TNF．a的产生，差异有显著性。其
中高浓度[150 mg／(kg·d)]组TNF—a含量与正常组
比较已无统计学差异，见图3。
2．6 淫羊藿苷对免疫细胞表型的影响 与正常组比较，
模型对照组小鼠CD3 T细胞和NKT细胞比例明显
降低。淫羊藿苷灌胃治疗小鼠l0天后，小鼠脾细胞表型
发生了明显变化，与模型对照组相比，小鼠脾淋巴细
胞中CD3 T细胞和NKT(CD3 NK1．1)细胞百分比
均显著升高(P<0．01)，其中淫羊藿苷高、低浓度组小鼠
CD3 T细胞百分比高于正常对照组。淫羊藿苷高、中浓
度组小鼠NKT细胞比例高于正常对照组，见表3。
3 讨论
环磷酰胺是临床上常用的细胞毒性化疗药物，在杀伤肿瘤细胞的同时，可损伤机体的免疫器官，抑
制机体的体液免疫和细胞免疫反应，造成免疫功能
的低下。本研究通过腹腔注射环磷酰胺建立了
C57Bk／6j小鼠免疫抑制模型，经检测发现该模型组
小鼠与正常小鼠比较，其脾脏和胸腺指数、淋巴细胞
数量、淋巴细胞增殖反应、脾单个核细胞TNF．a的产
生、CTL和NK细胞杀伤活性均显著降低，表明该免
疫抑制模型已经建立成功，可以模拟临床上使用放、
化疗治疗后患者的免疫功能状态。
淫羊藿苷(淫羊藿苷)是淫羊藿一种主要活性成分，近
年已被作为一种新型的生物反应调节剂进行研
究lHj。本实验研究发现灌服淫羊藿苷的免疫抑制小鼠
以上各项免疫指标均有所升高。胸腺和脾脏是机体
的主要免疫器官，其中胸腺是T细胞产生、分化和成
熟的主要场所，而在脾脏内T和B细胞接受血源性
抗原的刺激而分化成熟，产生效应T细胞和浆细胞。
因此，胸腺和脾的良好状态是机体能否行使正常免
疫功能的重要保障。脾脏和胸腺指数则反映了免疫
器官的发育和免疫细胞的功能状况。本研究结果显
示，淫羊藿苷提高了免疫抑制小鼠的脾脏指数和胸腺指
数，促进了免疫抑制小鼠免疫细胞的增殖和成熟，这
与本研究观察到的淫羊藿苷处理组小鼠外周血和脾淋巴
细胞数量显著增高，以及T淋巴细胞增殖反应率明
显升高的实验结果相符合。T淋巴细胞是机体发挥
抗肿瘤功能的主要特异性效应细胞，它介导的细胞
免疫应答是主要的免疫效应机制之一。淫羊藿苷介导的
小鼠T淋巴细胞数量增加和受ConA刺激增殖反应
率的提高将有助于其自身细胞免疫功能的增强，从
而更好地发挥自身抗肿瘤免疫功能。研究还发现，
淫羊藿苷处理组小鼠脾单个核细胞来源的CTL和NK细
胞杀伤活性增强，且脾单个核细胞产生TNF-~含量
明显升高，说明淫羊藿苷增强了小鼠特异性和非特异性
免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤活性，其机制可能与
淫羊藿苷促进小鼠脾单个核细胞TNF-a的产生相关。
NKT细胞在胸腺内发育分化后释放到脾、肝和
外周血中，是一群既具有T细胞又具有NK细胞特
性的细胞亚群，关于该细胞亚群与抗肿瘤免疫功能
方面的研究已经受到广泛关注_l11 J，目前研究发现
NKT细胞在某些肿瘤患者中数目减少，并且在肿瘤
患者中NKT细胞分泌细胞因子的能力降低l13]。
CD3 NK1．1是C57BL／6j小鼠体内NKT细胞的特异
性表达标志物，在小鼠肿瘤模型中NKT细胞的抗肿
瘤作用已非常明确[1引。本研究结果显示，cv处理
组小鼠脾脏内CD3表达阳性细胞(T细胞)以及CD和NK1．1双阳性表达细胞(NKT细胞)显著减少，而
淫羊藿苷各浓度处理组小鼠脾细胞中NKT细胞和CD3 T
细胞的比例均有所提高，这可能与淫羊藿苷促进胸腺和
脾淋巴细胞分化成熟，从而增加了NKT和CD3 T细
胞的比例有关，证明淫羊藿苷可通过提高CD3 T细胞和
NKT细胞的比例来增强机体发挥抗肿瘤免疫功能。
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