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| 葡萄籽原花青素的单元结构 |
葡萄籽原花青素(GSP)是一种天然植物多酚类
化合物，具有保护心血管系统、清除自由基、抗氧化、
抗突变、抗癌、抗辐射、促进细胞增殖等生物学活性，
被广泛应用于药品、保健品、食品、化妆品等领域。
为进一步纯化葡萄籽原花青素粗提取物，常用
大孔吸附树脂除去蛋白、多糖、黄酮类化合物等杂质，效果较理想的树脂有AB．8树脂、ADS一8树脂等。
采用交联葡聚糖凝胶Sephadex LH一20分离法进行
分级纯化_1 ，可以除去一些结构和极性与原花青素
接近的类黄酮物质，获得低聚葡萄籽原花青素单体
物质。国内外学者采用HPLC、红外光谱、激光光散
射、液质联用质谱(LC．MS)等多种方法来研究花青
素的结构，测定原花青素的平均分子量和分子量分
布及所含单体的构成等 。
本研究试图采用HP-2MGL大孔吸附树脂与
Sephadex LH一20凝胶柱联合纯化葡萄籽原花青素，
并对其进行硫解；利用LC—MS对分离纯化后的原花
青素单体成分和硫解后的原花青素结构单元进行定
性分析，并用红外光谱仪对葡萄籽原花青素的主要
结构单元进行快速分析与判断。
l 材料与方法
1．1 主要仪器与材料
1．1．1 主要材料赤霞珠(Cabernet Sauvignon)酿
酒葡萄籽由秦皇岛市华城葡萄酒厂提供；葡萄籽原
花青素标准对照品(纯度≥99％)由天津尖峰天然
产物研究开发有限公司提供；HP 2MGL大孔吸附树
脂购于日本三菱公司；Sephadex LH-20购于美国
Pharmaeia公司；四氢呋喃(进口色谱纯)由美国
Sigma公司进口，其他化学试剂如甲醇、丙酮、乙酸
乙酯、乙醇、乙酸酐、吡啶等均为分析纯。
1．1．2 主要设备 UV．1100紫外一可见分光光度
计，购自北京瑞利分析仪器公司；Waters 600／650E
高效液相色谱仪，购自美国Waters公司；Waters
2690液相色谱仪含二极管阵列检测器，购自美国
Waters公司。
1．2 试验方法
1．2．1 葡萄籽原花青素纯化物的制备大孔树脂
HP-2MGL纯化物的制备：将葡萄籽原花青素用水
溶解后上HP-2MGL树脂柱，分别用去离子水、30％
乙醇、50％ 乙醇、70％ 乙醇分步洗脱，分别收集30％
乙醇洗脱物(即葡萄籽原花青素纯化物1，简称
GSPP1)、50％ 乙醇洗脱物(GSPP2)、70％ 乙醇洗脱
物(GSPP3)，浓缩，冻干。Sephadex LH一20纯化物的
制备：将GSPP3用甲醇溶解上柱，分别经30％、
50％ 、70％ 甲醇依次洗脱后，再用50％丙酮洗脱，收
集丙酮洗脱物，浓缩，冻干，得到GSPP3纯化产物
(以下简称GSPP3一SP)。丙酮洗脱1．5个柱体积得纯化物1(以下简称GSPP3一SP1)，继续洗脱1．5个
柱体积得纯化物2(以下简称GSPP3一SP2)。
1．2．2 LC—MS测定葡萄籽原花青素 配制葡萄籽
原花青素溶液，进样量10 l，用Lichrospher C 柱分
离分析。柱温3O℃ ，流动相为乙腈一水-0．1％ 乙酸，
梯度洗脱，流速为0．5 ml／min。
1．2．3 葡萄籽原花青素的解聚取葡萄籽原花青
素5 mg，加入5％苄硫醇乙醇液2 ml，在棕色瓶中混
合。加入0．5 ml冰醋酸，超声波处理5 min。在90
℃水浴锅中，保持恒温60 min，迅速冷却至室温，用
0．45 txm微孔滤膜过滤，待测。
1．2．4 葡萄籽原花青素的红外扫描光谱分析取
1～2 mg葡萄籽原花青素，加入200 mg KBr，混匀，
在玛瑙研钵中研磨、压片。在红外光谱仪中先对纯
KBr薄片进行背景扫描，然后对含有样品的KBr薄
片进行扫描，得到葡萄籽原花青素的红外光谱图。
2 结果与分析
2．1 葡萄籽原花青素纯化物的单体结构分析
葡萄籽花青素粗提物经HP一2MGL和Sephadex—
LH一20纯化得到葡萄籽原花青素纯化物GSPP3．SP1
和GSPP3一SP2。通过HPLC分析发现，GSPP3一SP1
有4个峰，GSPP3．SP2的高效液相谱图有7个峰(图
1)。对LC—MS进行质谱分析(图2、图3)发现，
GSPP3一SP1和GSPP3．SP2含有大量荷质比(m／z)
287、289、290、408、426、577、578、580等分子离
子及碎片质谱信息，在质谱图中未发现荷质比(m／
z)441(表儿茶素没食子酸酯)和305(表桔儿茶素)
的碎片信息。这说明在GSPP3一SP1和GSPP3一SP2
的组分构成中不含有表桔儿茶素和表儿茶素没食子
酸酯，属于非酯、非桔型二聚体原花青素，是由儿茶
素与表儿茶素聚合而成的原花青素。这是因为葡萄
籽原花青素一般含有3种单体：(+)一儿茶素、
(一)一表儿茶素及(一)一表儿茶素没食子酸，酯，相
对分子质量分别为290、290及442，相应的分子负
离子[M_H]一m／z分别为289、289及441。各单体
(C 一C -C 黄烷醇骨架结构)之间以C 一c 或C 一
c 相连，形成原花青素的二聚体。
据报道 J，聚合体原花青素的碎片断裂方式主
要包括结构单元问的共价键断裂(C 一c 或C 一
C )和RDA反应(Retro．Diels．Alder反应)。RDA反
应是指原花青素二、三聚体的c一环断裂，失去1个中性的C H 0 结构(相对分子质量152)，形成的离
子片段还可以进一步失去1分子H：0，这样就会出
现荷质比(m／z)425和408碎片。国外学者发
现 圳，三聚体原花青素的RDA反应，只产生荷质比
(m／z)713，而没有荷质比(m／z)425和408碎片。
根据原花青素聚合体结构中各单体黄烷醇连接
键的位置，可以将原花青素结构单元分为上部单元、
中部单元和底部单元。上部单元仅以C 与中部单
元相连，中部单元以C 或C 或C 与上部单元和底
部单元相连，底部单元则以C 或C 与上端中部单元
相连(图4)。因此，原花青素聚合体结构单元的断
裂可能失去上部单元(C H 0 )中性碎片，形成荷
质比(m／z)为[M-288-H]一的离子。还可能失去底部单元(C H O )中性碎片，形成荷质比(m／z)为
[M．290．H]一的离子。二聚体原花青素中的内部黄
烷醇键以苯醌．亚甲基方式裂解，产生荷质比(m／z)
287([M 一3H]一，次甲基苯醌)和289([M下一H]一，
黄烷．3一醇单体)碎片，后者比前者离子碎片多，而三
聚体原花青素只检测到荷质比(m／z)575([M下一中一
3H]一)和289，未检测到荷质比(m／z)287 。
对于GSPP3．SP1来说，其5．45 min和1O．10
min所出现的2个峰的质谱图非常相像，且都含有
m／z为287、289、290、408、426、577、578等质谱
碎片信息，碎片断裂方式符合RDA反应特征，因此
可以断定两者是由儿茶素和表儿茶素构成的原花青
素二聚体的同分异构体。同理，7．31 min和11．6min所出现的2个峰的质谱图也非常相像，含有m／z
为289、290、580等质谱碎片信息，但不含有m／z为408、426、577、578等质谱碎片信息，其碎片断裂方
式不符合二聚体原花青素的RDA反应特征，推断两
者也为同分异构体，原花青素的单体即为儿茶素和
表儿茶素。根据资料报道，RP-HPLC中(+)-儿茶素
在(一)一表儿茶素之前出峰，因此认为7．31 min时出
的峰为(+)-儿茶素，11．60 min时出的峰为(一)一表
儿茶素。对于GSPP3一SP2来说，它除了GSPP3一SP1
中的2对原花青素同分异构体外，还含有3种其他
原花青素类物质，其中6．54 min和9．22 min所出现
的2个峰的质谱图也非常相像，含有m／z为287、
289、290、407、408、426、577、578等质谱碎片信
息，符合二聚体原花青素的RDA反应特征，推测两者也为原花青素二聚体的同分异构体；15．73 rain所
出现的峰含有m／z为290、407、408、426、577、578等
质谱碎片信息，可以推断其也为原花青素二聚体的
同分异构体。
2。2 硫解后葡萄籽原花青素结构单元分析
据报道，聚原花青素分子在苄硫醇的作用下
能够完全降解，其末端单元结构与氢原子结合成为
儿茶素或表儿茶素(相对分子质量为290，分子负离
子[M—H]一m／z为289)或表儿茶素没食子酸酯(相
对分子质量为442，分子负离子[M—H]一m／z为
441)，延续端降解下来的单元结构(C 一C 一C )与苄硫醇结合，分别生成儿茶素苄硫醇和表儿茶素苄硫
醇(相对分子质量为412，分子负离子[M—H]一m／z
为411)，其结合部位有C 和C 或C 和C ，因此有
多种结构(图5)。
GSPP3硫解后的LC—MS总离子流和选择离子
峰见图6，根据质谱的分子负离子峰[M—H]一m／z为
289、441、41 1，可推断总离子流中的选择离子峰依次
为儿茶素、表儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、儿茶素
苄硫醇(结合位C 或C。)、表儿茶素苄硫醇(结合位
C 或C )、表儿茶素没食子酸酯苄硫醇，说明GSPP3
结构单元中含有这6种物质。
2．3 葡萄籽原花青素的红外光谱特征
葡萄籽原花青素提取物经大孔树脂HP．2MGL
吸附纯化后，分别得到葡萄籽原花青素纯化分级级
分GSPP1、GSPP2、GSPP3。红外光谱(图7)分析发
现，葡萄籽原花青素的特征骨架振动波数主要集中
在1 000～1 650 cm 和700～850 cm 2个区域，
GSPP2和GSPP3的红外谱图峰形比较接近，主要是
因为GSPP2和GSPP3的原花青素含量较高，非原花
青素成分含量较低，且两者的原花青素基本结构单
元构成相似，因此其特征骨架振动受其他成分的干
扰较小，表现为其红外图谱形状差异较小。
将原花青素纯化级分GSPP1与GSPP2和
GSPP3的红外光谱图进行比较，发现GSPP1的振动
波数在1 100～1 400 cm和750～850 cm 骨架特征
振动区域与GSPP2和GSPP3有所不同，其主要原因
是葡萄籽原花青素含有较多的羟基，与大孔树脂结
合较为紧密，30％ 乙醇的洗脱能力较弱，洗脱物
(GSPP1)中含有一些酚酸、黄酮等物质¨ ，由于香
豆酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸等酚酸物质不含有B-环，其骨架特征振动与原花青素有很大差别。黄酮
与原花青素虽然都属于黄酮类化合物，但是他们在
结构上也有一定的差异，表现为骨架特征振动有一
定差别，使红外光谱图形状发生一定的改变。而
50％和70％乙醇洗脱能力较强，可以将吸附在大孔树
脂上的大部分原花青素洗脱出来，两者成分的差别主
要在于其原花青素构成和聚合度的不同，因此GSPP2
与GSPP3的红外光谱形状十分相似，而与GSPP1有
一定差别。
原花青素的红外光谱特征振动频率与其结构相
关，B环羟基的数量变化对原花青素的红外光谱有
直接影响。根据对26种聚原花青素的研究，可将其
红外吸收光谱分为5类，即A、B、C、D、E。A类是以
原花青定为主的聚原花青素，结构单元为顺式(主
要是表儿茶素)；B类是以原花青定为主的聚原花青
素，结构单元有顺式和反式(主要为等量的儿茶素
和表儿茶素)；C类是由原花青定与翠雀定混合的聚
原花青素，结构单元有顺式和反式(主要为表樯儿
茶素、表儿茶素与一定比例的儿茶素、桔儿茶素)；D类是以翠雀定为主的聚原花青素，结构单元为顺式
(主要为表桔儿茶素)；E类是以翠雀定为主的聚原
花青素，结构单元为反式(主要为桔儿茶素) 。经
比较发现：葡萄籽花青素提取物和纯化物的红外谱
图与聚原花青素A类红外图谱较为相似，在
1 520～1 540 em处有1个单峰，在780—770 cm处
有较多的显著特征峰。在芳环骨架伸缩振动特征区
域，以翠雀定为主的聚原花青素在1 540～1 520 em
强振动频率区有2个峰，以花青定为主的聚原花青素，在1 520～1 535 em 区域只有1个峰。当原花
青素聚合体中翠雀定结构单元含量超过60％时，在
其红外光谱1 520 C1TI处有2个峰；当聚合体中含
48％翠雀定结构单元时，其红外光谱在1 520 em处
只有1个峰。以花青定为主的聚原花青素面外变形
振动频率较高，在780～770 cm 区域有显著的强吸
收谱带，而以翠雀定为主的聚原花青素面外变形振
动频率较低，在730 CITI附近有显著的强吸收谱带，
由此推断葡萄籽原花青素提取物和纯化分级级分是以原花青定为主要结构单元的聚原花青素(主要为
顺式表儿茶素)，原翠雀定含量较少。
2．4 葡萄籽原花青素醇解产物的LC．MS
将葡萄籽原花青素进行醇解使之完全转化为花
色素，并进行LC．MS分析。由图8可见，11．96 min
出现1个峰；对该峰进行波长扫描，发现其在227
nm、277／lm、536 nm波长处有最大吸收；其分子正离
子(M )为287，分子负离子(M一)为285；通过选择
分子离子峰，发现M 287出峰时间为12．10 min，
M一285出峰时间为12．07 min。鉴此，可以确定该
产物为矢车菊素，相对分子质量为286，即葡萄籽原
花青素水解产物主要为矢车菊素，其B．环上含有两
个羟基，从而证明葡萄籽原花青素主要结构单元为
原花青定，正好与葡萄籽原花青素红外光谱图特征
峰的推断结果相吻合。
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