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| 液相色谱-质谱分析葡萄籽提取物中原花青素 |
原花青素(proanthocyanidins)是植物中一类双黄
酮衍生物的天然多酚化合物的总称，由于在酸性介质
中加热产生花青素而得名¨J。该类物质广泛存在于
葡萄、蓝莓、樱桃、李子和松树皮等，其中葡萄籽是其重
要来源。原花青素具有很强的抗氧化作用，在人体内
的抗氧化活性和清除自由基能力是维生素E(V )的
50倍，维生素C(V )的20倍 J，且具有保护心血管、
预防高血压、抗肿瘤、抗辐射等作用[3-5]。原花青素是
由包括儿茶素、表儿茶素、表儿茶素没食子酸酯和没食
子酸等单体，以及这些单体通过C 一C 、C ．C 键结合而
成的低聚体和高聚体等组成的混合物。通常将2～4
聚体称为低聚原花青素(oligomeric pr()anthocyanidins，
OPC)，将四聚体以上的称为高聚原花青素(polymeric
pr0anthocyani(1ins，PPC)，其中原花青素低聚体的抗氧
化性最强。。 。目前，分离原花青素的方法有溶剂萃取
法、膜过滤法、反渗透法、色谱法等 。但是由于聚合度、单体形式、连接键不同，原花青素结构非常复杂，
分离出其中的每种单一成分较困难。笔者在本实验中
采用快速高分离度液相色谱一串联质谱(RRLC—MSMS)
法分离分析葡萄籽提取物中原花青素的成分。
1 材料与方法
1．1 仪器 Agilentl200快速高分离度液相色谱仪
(RRLC)，Agilent6410 串联三重四级杆质谱仪
(MSMS)，RE一52旋转蒸发仪(上海安亭电子仪器厂)，
台式高速离心机(北京时代北利离心机有限公司)。
1．2 试药 儿茶素对照品[成都曼思特生物科技有
限公司，纯度98％ ，高效液相色谱(HPLC)级，批号：
A0160]，表儿茶素对照品(成都曼思特生物科技有限
公司，纯度：98％ ，HPLC级，批号：110878．200102)，表
儿茶素没食子酸酯对照品(成都曼思特生物科技有限
公司，纯度：98％ ，HPLC级，批号：A0160)，甲醇、甲酸
均为色谱纯(美国TEDIA Co．)，乙醇、正己烷为分析
纯，葡萄籽(新疆乌鲁木齐五一农场提供，未发酵)。
1．3 实验方法
1．3．1 对照品溶液的制备精密称取儿茶素对照品、
表儿茶素对照品、表儿茶素没食子酸酯对照品各
10 mg，分别用甲醇溶解并定容至50 mL，经微孔滤膜
过滤后取续滤液进样。
1．3．2 样品溶液的制备 将干燥葡萄籽粉碎过102
mm内径粉碎室，料液比1：5，60℃下用正己烷脱脂2
次，过滤，滤渣阴干后用70％ 乙醇以1：6的料液比，
在60℃下提取2次，合并提取液，提取液减压浓缩后
以6 000 r·min。离心40 min得上清液。上清液经
HPD400A大孔吸附树脂吸附后，先用纯化水淋洗去除
水溶性杂质，再用50％ 乙醇洗脱，得50％ 乙醇洗脱液，
经微孔滤膜过滤后取续滤液进样。
1．3．3 仪器条件色谱条件：色谱柱Agilent XDB—C
(2．1 ram~50 mm，1．8 m)，流动相A：1％ 甲酸，B：甲
醇一1％ 甲酸。梯度洗脱：0～5 min 100％A；～20 min
100％ A—— 85％ A +15％ B：～30 min 85％ A +15％ B_
65％ A+35％ B：～40 min 65％ A+35％ B—}20％ A+80％
B。流速0．2 mL·min～。柱温40 cc。进样量3 txL。
质谱条件：干燥气温度350 oC；干燥气流量9 L·min一；
雾化气压强275．8 kPa；毛细管电压一4 000 V；源内碎
裂电压135 V；母离子扫描范围m／z 250～1 200 amu。
2 结果
笔者在本实验中以负离子为选择离子检测葡萄籽
提取物中原花青素各成分。葡萄籽提取物中的原花青
素结构较复杂，包括原花青素单体、低聚原花青素和高
聚原花青素。其中，单体主要有儿茶素、表儿茶素、表儿
茶素没食子酸酯、没食子酸，相对分子质量分别为290，
290，442，170，相应的母离子m／z分别为289，289，441，
169。各单体通过C ．C 、C C 键结合形成原花青素二
聚体、三聚体、四聚体等各聚体，相对分子质量分别为
578(二聚体)，730(二聚单酯)，882(二聚二酯)，866(三
聚体)，1 018(三聚单酯)，1 154(四聚体)等，母离子m／z
分别为577，729，881，865，1 017，1 153等¨ 。
笔者在本实验中采用的液相条件能较好地分离出
原花青素单体及部分原花青素低聚体。对照表儿茶素、
儿茶素和表儿茶素没食子酸酯的标准品的总离子流图
中的质谱信息(图1～3)，样品溶液(图4)检测出3种原
花青素单体，分别是儿茶素、表儿茶素及表儿茶素没食
子酸酯，其出峰时问均和3种单体标准品的出峰时问一
致。因形成原花青素的单体形式不同及单体之问连接
键不同，所以即使聚合度相同的原花青素也表现出多种
结构，且这些结构极性相近，要想分离鉴定出每种结构
十分困难，并且需要较高品质的标准品。目前国外仅分
离出几种结构的原花青素，并且具有部分标准品，但仍
有很多结构未被分离出，国内市场尚没有原花青素聚合
体中单一成分的标准品。根据文献报道中原花青素各
聚合体的相对分子质量信息，样品溶液还检测并初步判
断出8种原花青素二聚体、1种二聚单酯、4种三聚体、1种三聚单酯和1种四聚体。详见表1。其中，质谱图中
峰4和峰8中成分均未分开，根据峰4和峰8中分别出
现的相对分子质量初步判断，峰4中可能包含原花青素
二聚体、三聚体和四聚体，峰8中可能包含原花青素二
聚体、三聚体和三聚单酯。
3 讨论
葡萄籽中原花青素具有复杂的结构和数量，各组
分极性相近，因此，同时分离分析出原花青素中的每种
单一成分较为困难。笔者在本实验建立了RRLC—
MSMS法分离并分析葡萄籽提取物中原花青素的成分
的方法，分离出3种单体，初步判断分离出二聚体8种，三聚体4种，四聚体、二聚单酯和三聚单酯各1种，效
果较好，为分离分析原花青素提供了一定的参考。
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