1 原花青素的提取方法

 植物材料中原花青素的提取率与材料的状况和 提取条件密切相关。植物材料的贮存、干燥、粉碎 度，提取溶剂、温度等都可能导致原花青素化学结 构的变化和提取率的改变，从而改变原花青素的理化性质和生物活性.

 当测定原材料中的原花青素含量时，贮存时间 越长，可能会导致测定结果降低。同时样品中的水 分含量也会导致测定结果降低。而且干燥条件的不 同也会导致提取率的变化，最好是采用冷冻干燥， 避免高温。

 样品提取前一般要经过粉碎，通常较细的粉末 有利于提取，但过细时提取率反而会降低。

 提取剂的选择也是影响提取率的关键因素。因 为原花青素在植物体内通常与蛋白质、多糖等以氢 键和疏水键形式形成稳定的分子复合物，原花青素 分子间也是如此。因此原花青素的提取剂，不仅要 求对其有很好的溶解性，而且还必须有氢键断裂作 用。因此有机溶剂和水的复合体系(有机溶剂占总 体积的50％ ～70％)最适合提取。有机溶剂的提 取能力顺序为丙醇<乙醇<甲醇<丙酮<四氢呋 喃，其中应用较多的是丙酮一水体系和甲醇一水体 系。

 当植物样品中铁等金属离子含量较大时，原花 青素在中性条件下与金属离子发生络合沉淀，沉积 在纤维中不利于提取。此时也必须采用酸化溶剂， 一方面断裂原花青素与蛋白质、多糖及本身离子间 的氢键和疏水键，另一方面断裂原花青素一金属离 子络合键，提高提取率。

 1．1 传统有机溶剂提取

 Ayroles等在1991年发明酮类化合物水溶液作 提取剂提取银杏叶中的原花青素的方法。采用酮类 化合物的水溶液作提取剂，提取液过滤后，用碱调 节滤液pH值至9左右，使原花青素沉淀，再用酸 调节滤液至pH值为2左右，在(NH4) SO 存在条件下用c ～c 酮类萃取滤液中的原花青素，除去酮类 化合物，干燥。

 Romanczyk等发明从可可中提取原花青素时， 对脱脂可可豆用质量分数70％MeOH／去离子水提 取后，再用质量分数70％丙酮／去离子水溶剂提取 2次，真空浓缩，除去有机溶剂后，再溶于水中， 用CHC1，提取，其水相用乙酸乙酯提取后，真空浓 缩除去乙酸乙酯，水相冷冻干燥，得到原花青素。

 1．2 绿色溶剂—— 水提取技术

 由于丙酮等有机溶剂可能带来环境污染和产品 的有毒有机物残留，人们在大力发展对环境友好的 绿色提取技术。1998年Duncan和Gilmour发明一 种从植物材料(树皮、树叶、葡萄籽、皮、大豆、 绿茶)中提取原花青素的方法。将材料粉碎(≤15 mm)，常压、60℃～100℃或高压100℃～125℃条 件下采用脱氧热水提取(1 min～20 h)，过滤采用超滤 或反渗透或两者连用，浓缩滤液，真空喷雾或冷冻 干燥，此法主要是提取分子量≤5 000 D的水溶性原 花青素，得率为0．5％～10．0％之间，通常为6．5％ 一9．6％ (随取样部位的差异而定)，分离得到原花 青素B 、B，、B 和c 。获得的产物对AAPH引发 的亚油酸的氧化有明显抑制作用，1肛g／mL能达 到70％～79％的抑制率。毒理学检测表明：对于按 人体重剂量给药组和100倍人体重量的剂量给药组 24 h内无毒害和副作用产生，慢性毒理学(5个月) 实验也无明显毒、副作用。

 1999年Karim等人发明了在加压条件下，采用 脱氧去离子水提取植物材料中的原花青素。将提取 液超滤后，采用疏水性微孔聚合物树脂作填料的柱 色谱方法，选用极性洗脱液(乙醇+水)洗脱，将 洗脱液采用反渗透方法除去乙醇，干燥得到原花青素。

 1．3 超临界流体萃取技术

 孙传经等发明一种采用超临界二氧化碳加丙酮 和水组成的极性改性剂，从银杏叶中萃取含有原花 青素提取物的方法。在萃取温度60℃～90℃，萃取 压力20 MPa～35 MPa下加入丙酮与水的体积比为 (50％～80％)：(50％～20％)的极性改性剂，萃 取时向2 h-4 h，进行静态、动态萃取。萃取液经传 统的树脂浓缩和喷雾干燥器干燥，得到精制银杏叶 提取物。产品含银杏黄酮甙>35 g／100 g，萜内酯> 8 g／100 g，原花青素<7 g／100 g，酚酸<5 mg／kg。 该法的优点是流程短，能萃取最强的天然抗氧化剂原花青素。2000年孙传经等又发明一种超临界CO 从黑加仑籽中提取黑加仑籽油和原花青素低聚物的 方法。该法分两步进行：第一步，是利用超临界 CO 提取黑加仑籽油，控制萃取压力在25 MPa一 29 MPa，温度为60℃ ；第二步是超临界CO2加人 丙酮与水的体积比为70：30的改性剂，CO 与改性 剂流量体积比为4：1，压力为22 MPa～25 MPa，温 度为60℃，提取原花青素低聚物。黑加仑籽油得 率为16％，原花青素低聚物得率为4％。该法优 点是同时获得两种产品，流程简单可靠，CO 和改 性剂循环利用，产品中无溶剂残留，对环境无污 染。

 1．4 微波提取技术

 刘征涛等发明了一种采用频率为2450 MHz或 915 MHz、功率为500 W～15 000 W 的微波对葡萄籽 在选用水、碳链长为C ～C，的醇、乙醚、丙酮、乙 酸乙酯、甲苯或其混合物的溶剂中进行处理，从葡 萄籽提取原花青素类物质的新方法。该方法较常规 化学法工艺简便、高效、快速，成本低，废液排放 量少。

 1．5 双水相萃取方法

 自1956年瑞典伦德大学的Albertsson发现双水 相体系到1979年德国GBF的Kula等人将双水相萃 取分离技术应用于生物产品分离，虽然只有20多 年历史，但由于其条件温和，容易放大，目前已成 功地应用于蛋白质、核酸和病毒等生物产品的分离 纯化。近几年来，有关双水相萃取技术提取中草药 有效成分的文献开始报道，尽管数量不多，但是已 有的实例充分表明其有良好的应用前景。用双水相 萃取体系富集分离银杏叶浸提液的研究，表现良好 的分配系数和分离效果。研究认为双水相体系具有 分相快，使用温度低，易于操作等待点，且所使用 的PEG及盐类对人体及环境无毒害，萃取率高，为 银杏黄酮化合物富集分离的一种有效方法。尽管双 水相萃取对中草药提取研究的应用处于起步阶段， 这一技术的应用有望为从天然产物中提取有效成分 提供一个新的思路。

 2 原花青素的纯化、分离

 2．1 液相萃取法

 原花青素的纯化多采用乙酸乙酯、甲苯、二氯 甲烷、醚等多级有机溶剂通过液相萃取的方法进行，这类方法因为有机溶剂用量大，对环境可能带 来污染，同时也容易造成产品中有毒有机物残留。

 2-2 柱层析法

 目前常采用的纯化方法多用柱层析法进行。王 建清等对大麦中的原花青素丙酮提取液，采用 PVPP树脂作柱层析的填料，以CH CN作流动相进 行纯化。

 Ricardo da silva等将葡萄用甲醇提取，提取液 回收甲醇后，通过聚酰胺柱进行初步分离，先用中 性水洗去酚酸，再用体积比30：70的乙腈／水洗脱 儿茶素，再用体积比75：25丙酮水洗脱原花青素， 进行纯化。

 刘睿等采用大孔树脂对高粱中的原花青素用乙醇 的水溶液进行纯化，得到产物纯度大于95 g／100 g的 低聚体原花青素。

 2．3 固相萃取法

 从复杂体系中选择性地萃取所需成分，固相萃 取(SPE)是其中最为有效的方法之一。1999年 Lazarus等人对杏仁皮、葡萄汁和红葡萄酒中的原花 青素采用SPE方法进行纯化，条件：supelcosil Envi一18 20mL SPE柱，流动相：丙酮：水：乙酸= 70：29．5：0．5 (体积比)。Kennedy和Waterhouse 对红葡萄酒中的原花青素采用c一18柱(Alhech)， 流动相：水和甲醇。洗脱除去有机酸、糖类和其他 不溶于有机相中的化合物而将提取得到的原花青素 进行纯化。

 2，4 凝胶色谱法

 凝胶色谱也常用于原花青素的纯化。 SephadexLH一20是一种对黄酮类化合物具有高度亲 和性的羟丙基化葡聚糖凝胶，Sephadex LH一20凝 胶色谱目前多用于原花青素的纯化和分离。但 Sephadex LH一20凝胶的物理特性决定其并不能对原 花青素进行高效率分离。所以进一步的纯化和分离 要采用凝胶过滤色谱或HPLC进行。

 此外，Sepherdex 75HR作为平均粒度为13 m 的葡聚糖聚合物，也用于原花青素的纯化、分离， 其能承受超过1．8 MPa的反压，尽管这种材料的商业 柱通常用于蛋白质的分离，发现其分离原花青素的 能力优于Sephadex LH一20。McMurrough和Madigan 将大麦提取液浓缩后，直接采用高效凝胶过滤色谱 (Sepherdex 75HR)，用甲醇洗脱，根据uV检测， 收集洗脱物，用DMACA鉴定每个组分。Escribano— Bail 6 n et al采用Sephadex LH一20和半制备RP—HPLC对葡萄籽中的原花青素进行纯化。

 Rigaud等对可可和葡萄籽的提取物，采用凝胶 渗透色谱(GPC)TSK G 2500 Hxl和TSK G3000 Hxl， 采用四氢呋喃(流速1 mL／min)洗脱进行纯化。

 2．5 微生物发酵法

 Ariga等发明一种由活性酵母，可将用水和有 机溶剂提取得到的提取物中的淀粉发酵除去而达到 纯化原花青素的目的；同时还发现纯化的原花青素 中金属离子也能较好的被除去，如果提取剂是水和 水／乙醇，能直接浓缩后发酵，若提取剂是丙酮， 则要除去丙酮后才能进行发酵。常用的酵母有：葡 萄酒酵母、酵母属和接枝酵母属的菌株。

 2．6 高速逆流色谱法

 高速逆流色谱技术由美国国家医学院Ito Yiochiro 博士20世纪60年代首创，最初是一种制备型色谱 技术，是一种不用固体载体或支撑体的液液分配色 谱，主要根据化合物在不相溶的两相间的分配能力 进行分离，具有分离效率高，产品纯度高，不存在 载体对样品的吸附和污染，制备量大，溶剂消耗 少，而且操作条件简单(室温、Teflon惰性柱材) 的特点。目前已被广泛用于天然药物材料的制备和 分析。

 目前高速逆流色谱仪已成功开发出分析型和制 备型两大系列。即高速逆流色谱仪既可用于天然药 物成分的制备分离，又可定量。进样量从几毫克到 克，进样体积从几毫升到几十毫升，不但适于非极 性化合物的分离，也适用于极性化合物的分离，既 适合于天然产物功效成分的粗分，也可进一步精 制、纯化。

 2-7 分子烙印技术

 分子烙印技术(molecular imprinting technology， MIT)是20世纪末出现的一种高选择性分离技术， 由于MIT模仿了生物界的锁匙作用原理，使制备的 材料具有极高的选择性，因而很快在许多相关领域 如手性分离和底物选择性分离、固相萃取、化学或 生物传感器、不对称催化和模拟酶等方面得到了应 用。在普通分离方面，较之传统方法，MIT法具有 高效、快速、专一的优点。MIT法在手性分离方面 的作用更是无与伦比。据统计，现有药物60％具 有一个或一个以上的手性中心，而对映体间的药效 及对人体影响有很大不同，因此1992年美国食品 和药物管理局规定，今后含不对称中心的药物必须 将光学异构体分离开。相对于传统方法的一筹莫展，MIT法就显得非常珍贵了。P>

 周力等人在2002年制备了以槲皮素为模板的 分子烙印聚合物(MIP)，从沙棘粗提物中分离提取槲 皮素和异鼠李素两种黄酮，得到良好的分离效果。 谢建春等用非共价法，在极性溶剂中、以丙烯酰胺 作功能单体，以强极性化合物槲皮素为模板，制备 了分子烙印聚合物(MIP)。液相色谱实验表明，MIP 对懈皮素具有特异的亲合性，将此MIP直接分离银 杏叶提取物水解液，得到主要含模板槲皮素及与槲 皮素结构相似化合物山奈酚两种黄酮的组分。研究 证实了MIP技术用于直接分离、提取中草药中具有 特定药效化合物的可行性。