| 沙棘是胡颓子科，多年落叶乔木或灌木，能防风固沙、 保持水分、改良土壤，具有优异的生态效益【1 J。主产于我国 内蒙、宁夏、青海等地，不仅是西部生态治理的优选植物，而 且具有很高的药用价值，被誉为“高原圣果”。近年来国内 外根据沙棘果实的传统用药，将鲜果开发出沙棘果汁、沙棘 口服液、沙棘油等产品，但是作为沙棘果实加工业副产品的 沙棘籽，还没有被有效的开发利用。国内外研究表明不同 沙棘籽提取物具有抗氧化作用，沙棘籽总黄酮有直接捕获 超氧自由基和羟自由基，清除大鼠体内自由基的作用[2-3 J。 而沙棘籽还富含原花青素[ ，原花青素(Proanthocyanidins) 是由不同数量的儿茶素或表儿茶素结合而成的黄烷一3一 醇衍生物的总称。目前对沙棘籽原花青素清除自由基的作 用研究未见相关报道，为此本文对沙棘籽原花青素进行体 外抗氧化作用的研究。
1 材料与方法
1．1 实验材料uv一2550紫外分光光度计(日本岛津)， FWll0型高速粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司)，RE— F20旋转蒸发仪(长城亚荣生化仪器厂)，AE240十万分之一 电子分析天平(瑞士梅特勒)；原花青素标准品(美国SIGMA公 司)，抗坏血酸(分析纯，广州化学试剂厂，批号20061108一 1)，儿茶素标准品(中国药品生物制品检定所)，其余试剂均 为分析纯。沙棘籽采自宁夏六盘山，经隆德县林业局鉴定 为中国沙棘亚种(H．rhamnoides L．subsp．sinensis Rousi)。
1．2 实验方法
1．2．1 DPPH法测定原花青素抗氧化、清除自由基的原理
二苯基苦味肼基自由基~DPPH·]是一种稳定的以氮为 中心的自由基，在517nm波长处有最大吸收。[DPPH·]乙 醇溶液呈紫色，其浓度与吸光度呈线性关系。在[DPPH·]乙醇溶液中加入原花青素后，原花青素可以与[DPPH·]结 合或发生替代，使[DPPH·]数量减少，溶液颜色变浅，表现 为：其在517nm波长处的吸光度不断减小，直至达到稳定。 因此，可以通过在517nm波长处检测原花青素对[DPPH·] 自由基的清除效果，计算其抗氧化能力。
1．2．2 DPPH标准曲线的制作
精密称定DPPH标准品9．06mg，乙醇定容至l(~nL，配 制成质量浓度为90．6t,e,／mL的标准溶液，置4℃冰箱中保 存备用。分别吸取1、1．5,2．5、5、10mL标准溶液，乙醇定容 至10mL，517rim测其吸光度，以浓度C为横坐标，以吸光度 A为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为A=0．0149C+ 0．0062．R2=0． 9994
1．2．3 沙棘籽提取物的制备
将干燥的沙棘籽用高速粉碎机粉碎处理，过100目筛， 称取适量，石油醚浸泡脱脂，晾干，85％丙酮提取，料液比为 1：4(m／v)，温度为30℃ ，回流提取14h后，冷却，抽滤，滤液 经旋转蒸发仪浓缩，得沙棘籽提取物干粉。
1．2．4 沙棘籽提取物中原花青素含量的测定
取一定量沙棘籽提取物干粉，配制成0．287mg／mL沙棘 籽提取物甲醇溶液，取lmL(另取lmL甲醇液为空白液)，加 入显色剂，3o℃恒温水浴30rain，500nm测其吸光度，根据儿 茶素标准曲线测得沙棘籽提取物中原花青素的含量为 76．52％ 。
1．2．5 自由基清除率测定实验
精密称定0．0501g沙棘籽提取物，乙醇定容至l(I)mL 分别配制浓度为0．0313、0．0625、0．125、0．250、0．501me／mE 乙醇溶液，作为实验组。同时配制等浓度梯度的抗坏血酸 作为对照组。采用动力学监测法 8，测定溶液随时间变化 的吸光度A，每30s取值1次，待吸光度基本不变时，药物与 自由基反应完全，记录最终吸光度。
式中：A0为未加药DPPH溶液的空白吸光度；Ai为加药后DPPH溶液的吸光度； 为样品溶液自身的吸光度。
1．2．6 清除自由基的半数有效量(EC5o)的计算和自由基 清除能力(AE)的评价
根据沙棘籽原花青素清除DPPH自由基的曲线，计算 得到DPPH自由基原始质量浓度减少至50％(稳定态)时沙 棘籽原花青素的用量为半数有效量(E )。自由基清除能 力(AE)，AE=1／ECso，根据AE的大小判断抗氧化剂清除自 由基的能力的大小。
2 结果
2．1 沙棘籽提取物吸光度一时间曲线及其自由基清除率(％)
自由基溶液中加入各浓度沙棘籽提取物溶液O．5h (1800s)后，溶液的吸光度不再改变，反应完全(图1)。记录 0．5h时的测定值 和 (表1)。
自由基溶液中加入各浓度抗坏血酸溶液0．5h(1800s) 后，溶液的吸光度不再改变，反应完全(图2)。反应时间与 样品组保持一致，同样记录0．5h时的测定值 和A．(表2)
2．3 实验组和对照组抗氧化活性对比
根据药物添加量与自由基清除率(％)的关系，制作二 者的关系曲线，通过线性回归分析得到回归方程，利用 SigmaPlot软件计算得出沙棘籽提取物清除DPPH自由基的 E 为93．0g／kg，AE为0．0107；抗坏血酸清除DPPH自由基 的EC5o为70．3g／kg，AE为0．0142
3 讨论
DPPH自由基法是判定药物体外抗氧化活性的经典实 验方法。本研究结果表明沙棘籽提取物随着剂量的增加， DPPH自由基清除率相应增加，并成剂量依赖关系，提示反 应初期原花青素与DPPH自由基结合生成DPPH—PheO，消 耗DPPH，降低DPPH的含量，当沙棘籽提取物剂量达 0．125mg／mL以上时，DPPH的含量不再出现相应的降低。 其机制可能是当DPPH减少到一定程度，就会出现原花青素芳香环上的羟基和DPPH自由基相互竞争与PheO·结合 生成PheO—PheO，从而抑制了原花青素与DPPH自由基的 结合所致
本次实验结果表明，沙棘籽提取物对DPPH自由基具 有清除作用。与相同浓度抗坏血酸的对比可知(图3)，沙 棘籽提取物剂量在0．0625mg／mL以上时，清除DPPH 自由 基的能力与抗坏血酸相当。抗坏血酸的自由基清除率在 1—2min之后即达到最大值(图2)，属快速抗氧化剂；沙棘 籽原花青素提取物的自由基清除率在3～5min后达到最大 值(图1)，属中速抗氧化剂。
本次实验结果提示，沙棘籽原花青素提取物能够清除 DPPH自由基，具有抗氧化活性，可在提取及含量测定上更 深入地进行研究，以达到开发新药的目的。 |
