基于以上研究结果，本实验首先针对丹参抗心 血管疾病活性建立微量、快速的体外抗氧化实验模 型。用紫外分光光度法，定量考察丹参中丹参素、原儿茶醛、咖啡酸和丹酚酸B羟自由基(·OH)的清 除能力，为寻找丹参治疗心血管疾病主要活性成分 提供依据。

 1 材料与仪器

 1．1 样品及样品溶液的配制 丹参素钠、原儿茶醛、咖啡酸和丹酚酸B。分别用双蒸水配制成1 mol／L溶液。

 1．2 试剂30％ H O 、结晶紫、硫酸亚铁购自上 海国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯。

 1．3 仪器紫外分光光度计(TU一1901，北京普析 通用仪器有限公司)，十万分之一天平(北京塞多利 斯仪器系统有限公司，BT255)，PHS-25型酸度计 (上海精密科学仪器厂)。

 2 方法

 2．1 实验方法与试液配制本实验采用经典Fen． ton反应¨l， J。该方法的工作原理：(1)Fenton反 应：过氧化氢在Fe 作用下被还原成羟自由基 (·OH)：Fe2 +H2O2— Fe +OH一+ ·OH；(2) 羟自由基(·OH)夺取多元酚类成分的一个氢而被 还原：·OH +Ar()H H，O +ArO·；(3)·OH 可以与结晶紫显示剂结合，使结晶紫褪色，吸收度降 低；当加入抗氧化剂后，·OH夺取抗氧化剂中的一 个氢而被还原，因此可以抑制结晶紫褪色，吸收度增 强。以高浓度逐渐稀释的方式检测不同浓度样品对 羟自由基清除率(CL)的影响，根据公式计算对羟自 由基(·OH)的清除率，建立量效关系曲线，通过量 效曲线算出CL为50％时样品的浓度(Ic∞)值，Ic卯 值反映了样品对羟自由基(·OH)的清除能力。 Ic，。值越小，表明样品清除羟自由基(·OH)的能力 越强。结晶紫溶液：结晶紫4．08 mg，用重蒸水溶解 并定容至50 mL。Tris缓冲溶液(pH=3．0)：三羟甲 基氨基甲烷6．05 g，加重蒸水溶解后调pH至3．0， 并用水定容至100 mL。硫酸亚铁溶液：硫酸亚铁 69．5 mg，加少量硫酸溶解，用水定容至100 mL。双氧水溶液：30％H：O：1 mL，用水定容至100 mL。

 2．2 羟自由基的产生与清除Fenton试剂是以过 氧化氢为氧化剂，以Fe 为催化体系的氧化法。 Fe 还原H：O 形成羟自由基(·OH)，·OH可以 和显色剂结晶紫结合，使结晶紫褪色，吸收度降低。 抗氧化剂可以清除·OH，·OH对多元酚类成分主 要是抽氢反应而被还原，因此可以减少·OH与结 晶紫结合，所以抑制结晶紫褪色，吸收度升高。羟自 由基的测定：在一系列10 mL容量瓶中分别加入 0．6 mL结晶紫溶液、1 mL Tris—HC1溶液、0．5 mL Fe 溶液和0．5 mL H O 溶液，用二次蒸馏水稀释 到刻度并摇匀，放置5 min后，在波长588 nm处测 定光密度D(A)值，计算其余空白参比D(A) 。 之差 AD(A)。羟自由清除率的计算：在上述的体系中， 加入一定量的待测溶液后，测定体系光密度D(A) ； 未加待测溶液的体系其光密度为D(A)。；未加Fenton试剂及待测溶液的体系其光密度D(A)，则清除 率CL按以下公式计算。

 3 结果

 3．1 量效关系的建立根据每个样品不同浓度时 对以上反应体系吸收强度的影响，分别对其清除羟 自由基的活性进行量效关系分析，并采用SPSS统计 软件对数据进行曲线拟合。数据分析表明，各样品 检测具有一定的浓度范围，在该范围内样品浓度与 自由基清除率有较好的量效关系。依据自由基清除 范围来确定样品浓度范围，自由基清除率在小于 80％ 时相关性较好，在该浓度范围内相关系数R > 0．95，以此确定样品浓度检测范围。所有样品量效 关系均呈线性相关，Y：kx+b，其中Y为清除率 (％)， 为样品浓度(mmol／L)。各样品量效关系、 浓度检测范围见表1。

 3．2 不同样品抗氧化活性及构效关系分析羟自 由基清除率为50％时的样品浓度(IC 。)可用于比较 各样品对自由基的清除能力，Ic 。值越小，说明其抗 氧化活性越强，Ic 。根据量效曲线方程求算得出。 表1显示了四种酚性化合物清除羟自由基的IC 。 值，其大小顺序为：丹参素钠>咖啡酸>原儿茶醛> 丹酚酸B。表明丹酚酸B的作用最强，丹参素钠、原儿茶醛和咖啡酸的作用相近，这3个化合物共同特 点是在苯环上连有邻二酚羟基。据文献报道，黄酮 和酚类化合物苯环上的邻二酚羟基是其抗氧化、清 除自由基的主要活性部位¨ ，酚类化合物与自由基 反应被抽去一个氢，生成半醌式自由基结构，由于邻 二酚羟基的存在，其半醌式结构相对稳定，抗氧化能 力随邻位酚羟基数目增多而增强，但当酚羟基数目 达到一定量时，抗氧化能力不再增强¨ 。丹参素 钠、原儿茶醛和咖啡酸的抗氧化活性比较接近，是因 为这3个化合物结构相似，只含有一对苯环上的邻 二酚羟基。丹酚酸B的抗氧化活性之所以比丹参 素钠、原儿茶醛和咖啡酸强，是因为丹酚酸B是由4 个咖啡酸单元聚合而成的化合物，存在4对苯环上 的邻二酚羟基，同时丹参酚酸B还具有交叉共轭结 构，有利于半醌式结构中自由基电子的稳定分布。

 g 讨论

 通过以上氧化体系对丹参中的4种水溶性多元 酚类成分抗自由基活性的研究分析表明，丹参中丹 参素、原儿茶醛、咖啡酸和丹酚酸B均有较好的清 除羟自由基活性，这4种成分中，丹酚酸B的抗自 由基活性强于其它3种成分，分析这4种化合物的 结构表明，其抗氧化活性与化合物结构中的邻二酚 羟基和其形成的自由基的稳定性有关。丹参素、原儿茶醛和咖啡酸的结构较相似，均含有一对邻二酚 羟基，因此抗氧化活性比较接近。而丹酚酸B与其 它3种成分结构存在很大差异，丹酚酸B有多对邻 二酚羟基和较多共轭结构，有利于电子云的均匀分 布，因此抽氢后形成的自由基很稳定，有利于氧化链 式反应的中断，而其它3种成分共轭体系较小，所以 抽氢后形成的自由基不太稳定，因此丹酚酸B的抗 氧化活性强于其它3种化合物，表明丹酚酸B是丹 参通过清除氧自由基治疗心血管疾病的重要活性成 分。