1 仪器与试药

 1．1 仪器LC一10AT型液相色谱仪泵主机(日本岛津)、 SPD—IOA型紫外检测器(日本岛津)；N-2000色谱工作站(浙 大智达)；AD一2型百万分之一电子天平(美国PE公司)；PHS一 25型酸度计(上海雷磁)。

 1．2 试药盐酸水苏碱(中国药品生物制品检定所，批号： 0720—9807，供含量测定用)；其它化学试剂均为分析纯。供试 样品：为本公司生产的中试及小试样品。

 2 盐酸水苏碱高效液相色谱法测定及方法学考察

 2．1 对照品溶液制备 精密称取盐酸水苏碱对照品2 mg， 置5 lnl量瓶中，加0．1 tool·L 磷酸二氢钠至刻度，超声使 溶解，摇匀，即得(每1 ml中含盐酸水苏碱0．4 nag)。

 2．2 供试品溶液制备取本品研细，取约5．0 g，精密称定，置50 ml三角烧瓶中，用乙醇超声提取5次，每次加乙醇20 ml，提取20 min，合并滤液，回收乙醇至干，残渣加0．1％盐酸 溶液10 ml，超声使溶解，离心，倾出上清液，再用10 ml 0．1％ 盐酸溶液洗涤沉淀，离心，合并上清液，加入新配制的2％ 硫 氰酸铬铵溶液5 ml，冰浴中放置1 h，用G3号垂熔漏斗抽滤， 沉淀用10 ml冰水分次洗涤，用15 m1丙酮溶解沉淀，在丙酮 液中滴加0．5％硫酸银溶液(约5 m1)至不再有沉淀产生，放 置，自然过滤，用70％ 乙醇15rrd分次洗涤沉淀，合并滤液和 洗涤液，置水浴上浓缩至约1 ml，放冷，加入与硫酸银等当量 的1％氯化钡溶液(约1、7 m1)，加水定量转移至5 ml量瓶中， 并用水稀释至刻度，用微孔滤膜(0．45 m)滤过，即得。

 2．3 色谱条件选择与系统适应性试验

 2．3．1 色谱条件选择色谱柱：磺酸基团键合硅胶(SCX) 的阳离子交换剂为填充剂(大连依利特科技有限公司Hyper— sil SCX 4．6 mm×250 mm色谱柱)；流动相：0．1 mol·L 磷 酸二氢钠；流速为：1．0 ml·min～；检测波长：192 nm；进样 量：10 l。

 2．3．2 色谱填充柱选择 由于盐酸水苏碱极性较大，参照文 献中采用高效液相法测定盐酸水苏碱含量的，其色谱柱选用 磺酸基团键合硅胶(SCX)的阳离子交换剂为填充剂。本标准 制订采用的是大连依利特科技有限公司Hypersil SCX 4．6 mm ×250 mm色谱柱。

 2．3．3 流动相选择由于本制剂中药味较多，成分复杂，给 分离带来极大困难，实验摸索了多种流动相，最后确定以0．1mol·L-1磷酸二氢钠为流动相，盐酸水苏碱分离度较好，保留 时间短(约7～8 min)，缺味阴性样品无干扰。

 2．3．4 柱温选择经实验摸索，控制在25cC最合适。

 2．3．5 测定波长选择 同时对盐酸水苏碱对照溶液在200 ～ 350 nm范围进行光谱扫描测定，结果盐酸水苏碱仅有末端 吸收，于192 nm波长处有最大吸收峰，因此，选择192 nlll作 为盐酸水苏碱的测定波长。

 2．3．6 系统适应性试验取供试品溶液，按色谱条件进样， 记录色谱图，结果理论板数按盐酸水苏碱峰计n>2 000。主 峰与周围的峰分离度R>1．5。

 2．3．7 理论板数(n)的测定取供试品溶液，按色谱条件下 进样记录色谱图，结果理论板数按盐酸水苏碱峰计 >2 000。

 2．3．8 分离度的测定主峰与周围峰的分离度R>1．5。

 2．4 方法学考察

 2．4．1 标准曲线与线性范围 精密吸取盐酸水苏碱对照品 溶液(每1 ml中含盐酸水苏碱25～500 g)各20 l，分别注 入液相色谱仪中，测定其色谱峰面积积分值。以盐酸水苏碱 对照品进样量C( g)为横坐标，相应色谱峰面积积分值A为 纵坐标绘制标准曲线分别为100616、158989,301530、593365、 1109383、1372023，并经统计学处理，得回归方程A=133302C +35839。对照品色谱图见图1A。由试验结果可知：盐酸水苏碱的量在0．5～10 g范围内呈良好的线性关系，含量测定 采用外标法。

 2．4、2 空白试验取缺味益母草阴性样品，依法操作，进行 液相色谱分析，结果表明其它成分对盐酸水苏碱测定无干扰。 缺味阴性对照色谱图见图1B。

 2．4．3 稳定性试验取供试品液，按含测依法操作后，立即 进样测定，并每隔一定时间重复进样测定一次，持续16 h，则 在0、2、4、8、16 h测得的吸光度值分值分别为1003560、 1025477、1016866、980968、1037903，RSD为2．15％ ，结果表 明：盐酸水苏碱峰面积积分值基本稳定。

 2．4．4 进样精密度试验取供试品溶液，连续进样5次，测 定其峰面积积分值，结果统计：相对标准偏差为RSD= 0．64％。供试品色谱图见图1C。

 2．4．5 重现性试验取同一批号的坤宁颗粒，按正文依法重 复操作测定5次，测得含量分别为0．41、0．42、0．44、0．45、 0．43 mg·g一，平均含量为0．43 mg·g。。，经统计学处理，相 对标准偏差RSD：3．68％ 。

 2．4．6 回收率试验采用加样回收法，取适量已知含量的同 一批号样品，分别精密加入一定量的盐酸水苏碱对照品，依法 操作测定，同法重复试验5次，测得盐酸水苏碱的平均回收率 为97．99％ ，RSD：2．10％ ，结果见表1。

 2．4．7 样品测定数据及含量限度的确定经对10批中试样 品进行盐酸水苏碱含量测定，盐酸水苏碱含量为0．42～0．49 mg·g一 (见表2)，每g颗粒含益母草0．1 g，按《中国药典》 J 2005年版一部“益母草”药材中盐酸水苏碱含量限度不低于 0．50％计算，按100％折算成品含盐酸水苏碱应为0．5 mg· g-1 ，考虑到益母草药材由于含量差异较大，结合复方制剂工 业化大生产的特点，将含量限度定在本品每克颗粒含益母草 以盐酸水苏碱(C H NO：·HC1)计，不得少于0．35 mg。

 3 讨论

 本试验是采用高效液相色谱法测定益母草中盐酸水苏碱含量的方法学研究。我们在参考了大量文献报道的基础上， 经过反复试验，确定了采用阳离子交换柱的HPLC法，结果表 明其方法较为准确、灵敏、重现性好、操作简便，可作为该制剂 的质量定量控制指标。