关键词:汉黄芩素 端粒酶 HL-60细胞

 端粒酶是具有模板功能的RNA和催化活性蛋白 组成的核糖核酸蛋白酶，能延伸端粒重复序列、稳定端 粒的长度，从而维持染色体的稳定性和DNA完整复 制⋯ 。人们已在95％ 以上的恶性肿瘤中检测出端粒 酶活性。端粒酶活性不适当的激活可能是恶性肿瘤发 生发展的原因之一，控制端粒酶活性已成为人们防治 癌症的新途径。汉黄芩是中药黄芩所含的一种黄酮类 化合物。本研究以HL一60细胞为模型，研究汉黄芩素对HL一60增殖和端粒酶活性的影响。

 1 材料和方法

 1．1 材料：HL一60细胞由广东医学院引进并在本室 传代保株。汉黄芩素；四 唑氮蓝(M1Tr)为Sigma产品；RPMI一1640培养液和DE． Pc为Gibco产品；端粒酶检测试剂盒为德国Boehringerr Manheiman公司产品。

 1．2 方法

 1．2．1 细胞培养：HL一60细胞在37℃ ，5％ CO2条件 下，培养于含10％胎牛血清(56℃ 灭活，30rain)、100IU 青霉素、lOO~g／ml链霉素的RPMI 1640培养液中，选对 数生长期细胞进行试验。应用汉黄芩素的细胞为用药 组，相同条件培养但不用药的细胞为对照组。

 1．2．2 汉黄芩素对HL一60细胞生长和增殖的作用：采用M1Tr法检测汉黄芩素对HL一60细胞生长和增殖 的影响，计算细胞生长抑制率。

 细胞生长抑制率=(1一试验组平均光吸收值／对 照组平均光吸收值)X 100％

 1．2．3 端粒酶活性检测：用 P—PCR—ELISA法进 行端粒酶活性测定，所有操作按试剂盒说明书要求进 行。汉黄芩素作用HL一60细胞后，制备端粒酶提取 液。RT—PCR扩增：① 引物延伸，取上述提取液5 l， 加反应混合液，置25℃ ，30rain；②PCR扩增：94℃ ，5min 后；变性94℃ ，30s，退火50℃ ，30s，延伸72℃ ，90s，共30 个循环，然后72％ ，10min；③ 扩增产物的检测，取5td PCR扩增产物，加20td变性试剂，室温10min，加入 225／A杂交混合液(含地高辛标记的检测探针)，充分混 匀之后，取100td于抗生素蛋白包被的微孔板上，37℃ 摇床杂交2h，加入过氧化物酶偶联的抗地高辛抗体， 室温30rain，TMB底物显色10rain，加终止液终止反应， 测定450nm和690nm处的吸光度。阴性对照为经 65℃热处理10min的HL一60细胞系蛋白提取物。 1．2．4 统计学处理：数据以孟土s表示，单因素方差分 析，组间均数比较采用t检验，率比较采用X2 检验。

 2 结 果

 2．1 汉黄芩素对HL一60细胞生长的影响：不同浓度的汉黄芩素对HL一60细胞的生长有明显的抑制作 用，其抑制作用呈浓度和时间依赖性，见图1。

 细胞培养时间(h)

 图1 汉黄芩素作用后HL一6o细胞的生长曲线

 2．2 汉黄芩素对HL一60细胞的生长抑制率影响：不 同浓度的汉黄芩素作用于HL一60细胞后，细胞的生 长抑制率逐渐升高，且随着时间的延长，细胞生长抑制 率与药物的浓度呈明显的量效关系，而同一的药物浓 度，其细胞生长抑制率呈明显的时效关系，见图2。

 细胞培养时间(h)

 图2 汉黄芩素对HL一6o细胞的生长抑制率

 2．3 汉黄芩素对HL一60细胞端粒酶活性的影响：见 图3。不同浓度的汉黄芩素作用于HL一60细胞后，细 胞的端粒酶活性随着浓度和时间的增加而逐渐减弱； 浓度为50vg／na的汉黄芩素对HL一60细胞的端粒酶 活性的影响比较弱，但浓度达lOOu~ml和200tag／ml 时，HL一60细胞的端粒酶活性下降得较为明显。

 图3 不同浓度汉黄芩素对HL一60细胞端粒酶活性的影响

 3 讨论

 端粒酶是一种RNA依赖的DNA聚合酶，端粒酶 的激活使端粒长度得以稳定，细胞获得无限增殖能力 成为永生化细胞。研究证明，绝大多数肿瘤细胞具有 端粒酶活性，而除生殖细胞以外的人体正常组织大多 为端粒酶阴性【2．3]。端粒一端粒酶系统的异常与恶性 肿瘤的发生、发展和预后有关，端粒酶的重新激活被认 为是恶性肿瘤发生的终末共同通路。抑制端粒酶活 性，破坏端粒的稳定，使癌细胞走向死亡，成为目前治 疗恶性肿瘤的一种新策略，端粒酶抑制剂有望成为安 全有效的抗癌药物。

 汉黄芩素是中药黄芩的主要成份之一，属黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化等功效。有研究认为其对肿 瘤细胞的生长有抑制作用【4．5 J。本实验研究发现汉黄芩素能明显地抑制人早幼白血病细胞HL一60的生 长，而且其对HL一60细胞的抑制作用呈浓度和时间 依赖性，浓度越大，时间越长，对HL一60细胞的抑制 作用就越大。当浓度大于100t~g,"ml时，汉黄芩素能较 明显地下调HL一60细胞的端粒酶活性，这可能是它 抑制细胞生长的原因之一。药物的抗肿瘤作用机理往 往是诱导肿瘤细胞凋亡。研究发现众多抗癌药物如顺 铂、紫杉醇等均能抑制肿瘤细胞生长导致肿瘤细胞凋 亡，同时下调肿瘤细胞端粒酶活性。意示着抗癌药物 下调肿瘤细胞端粒酶活性与诱导肿瘤细胞凋亡可能存 在一定的相关性。黎丹戎等【6J研究发现50 250tag／ml 的汉黄芩素能诱导卵巢癌细胞凋亡。但这是否与汉黄芩素下调它的端粒酶活性有关还有待进一步研究。

 目前，药物防治肿瘤的作用已经越来越大，大量的 化疗药物已应用于临床。但是大多数的化疗药物的毒 副作用往往比较大，而来源于植物的天然药物成份因 其毒副作用相对比较小而受到人们的青睐。把抗癌药 物的研究转向天然药物是人们的首选。而端粒酶活性 作为癌症新的标志物，把它与抗癌药物结合起来将有 较好的研究前景。