1 材料

 1．1 细胞人卵巢癌SKOV3细胞由广西肿瘤防治研究所提供。 培养于含10％的小牛血清，100 u／m1青霉素和100 ml链霉素的RPMI一1640培养液中，37％ ，5％CO 培养箱中孵育培养、传代。

 1．2 药物汉黄芩素是从黄芩根中分离出的一种单体，分子量为 284 kDa，黄色晶体，其化学性质、理化性质、光谱数据参见文 献 J。注射用顺铂(冻干型)，齐鲁制药有限公司生产。

 1．3 裸鼠裸鼠由上海斯莱克实验动物有限公司提供，4周龄， 约20 g左右，雌性，生产许可证SCXK(沪)2004—0005。

 2 方法

 2．1 动物分组及给药将对数生长期的人卵巢癌细胞SKOV3经 胰酶消化后，制备成10 ／ml的细胞悬液，每只裸鼠腋部皮下接种 0．2 ml，约2周后接种原位出现肿瘤，成功率为27／30。选取其中 25只裸鼠随机分为5组即：汉黄芩素高剂量A组600 mg·kg · d ；低剂量B组300 mg·kg～ ·d ；常规治疗C组腹腔注射 顺铂3 mg·kg～ ·d～；联合用药D组同时用腹腔注射顺铂3 mg · ～ · d 和灌胃给药600 mg·kg～ ·d～；空白对照E组灌生 理盐水10 m1．kg～ ·d ；采用灌胃给药开始治疗，共用药10 d。 停药7 d后处死所有裸鼠，取瘤块并分成约0．1 份，福尔马林 固定，石蜡包埋。常规HE染色。

 2．2 检测裸鼠组织中hTERT，Bcl一2，Bax蛋白的表达方法采用抗生素一生物素过氧化酶复合物(S—P)免疫组化法。

 组织切片0．4 m，55％ 烤片过夜，常规脱蜡，高压修复抗 原，PBS洗涤3次。3％H202孵育，室温5～lOmin，H 02要覆盖 组织，PBS洗涤3次，滴加1：100的1抗，孵育1 h。PBS洗涤3 次。滴加生物素标记的第2抗体，37％ ，10～15rain，PBS洗涤3 次。DAB显色，用中性树脂封片。

 对照设置：阳性对照片染色步骤同上述；阴性对照片用PBS 代替一抗；其余步骤同上。

 2．3 检测裸鼠组织中凋亡指数表达(TUNEL法)组织切片，常 规脱蜡，20~g／ml的蛋白酶K室温下消化20 rain，PBS洗5 rain x 3次。3％H 0 甲醇液阻断内源性过氧化物酶20 rain。PBS洗5 min×3次。3％牛血清白蛋白阻断20 min，PBS洗涤，TUNEL反 应液，60 min，PBS洗3次，加入转换液，37℃ ，30 rain。PBS洗涤3 次。DAB显色，3～5 min，苏木素染l0～20 rain，电吹风吹干，中 性树脂封片。

 对照设置：阳性照片为加TUNEL反应液前用DNA酶I消化 30rain，阴性对照片不加TUNEL反应液中的TdT，其余步骤同上。

 2．4 免疫组化判断

 2．4．1 对照染色每批染色的阳性对照片应显示为阳性，阴性对 照片应显示为阴性，否则整批片重染。

 2．4．2 免疫组化染色阳性判断标准hTERT蛋白阳性反应位于 胞浆和胞核中表达；Bcl一2，Bax蛋白阳性反应位于胞浆内表达， 呈棕褐色或棕黄色。

 2．4．3 免疫组化染色分级在全片上、下、左、右、中各随机选取 一个400倍视野，观察每个视野中阳性细胞的染色强度及该强度 细胞占视野中所有癌细胞的百分率。

 分级：按阳性细胞占总细胞数的百分率分4级，I级：5％ ～ 25％ ；II级：26％ ～50％ ；III级：51％ ～75％ ；IV级：>75％ 。≥ 5％作为阳性标准，<5％作为阴性标准。

 阳性细胞的染色强度分为4级：1级：(±)；2级：(+)；3级：(+ +)；4级：(+++)。各阳性对照片的染色强度定为4级作为参照。

 一个视野的免疫组化染色得分 =该视野中的各种染色强 度与该强度阳性细胞的百分率级别的乘积之和，即染色强度为1 级的阳性细胞百分率级别×1+染色强度为2级的阳性细胞百分 率级别X2+染色强度为3级的阳性细胞百分率级别X 3+染色 强度为4级的阳性细胞百分率级别X 4。该组织的免疫组化染色 综合得分=5个视野的免疫组化染色得分之总和÷5。

 2．4．4 细胞凋亡判断及记数凋亡细胞核固缩呈圆形或椭圆形、 蓝黑色，染色体沿核膜形成半月状或新月状，部分核凝固成致密 小圆球形。光镜下随机选取5个以上高倍视野，每个视野不少于 1000个细胞，按阳性细胞占细胞总数的百分率作为凋亡指数。

 2．5 统计学分析用SPSS13．0统计软件，数据以均数±标准差 表示，两样本均数的比较用t检验。多个样本均数的比较，方差 齐用q检验法，方差不齐用秩和检验；率的比较用确切概率法；相 互依存关系的检验用方差分析F检验。

 3 结果

 3．1 肿瘤组织病理学观察各组裸鼠解剖时均未见胸水、腹水； 联合组瘤体最小，易剥离，血供较差，切面灰白，并有液化坏死区 域。显微镜下见对照组癌细胞生长旺盛，形成癌巢，细胞形态不 规则，大小不等，核大呈圆形或卵圆形，核膜增厚，核分裂相较多。 药物作用后联合用药D组癌细胞呈大片坏死，结构不清，大部分 癌细胞崩解，偶见残余的癌细胞，间质纤维化，角质物质增多癌组 织发生退行性变化，高剂量A组、低剂量B组及常规治疗C组癌 细胞变性坏死，偶见核分裂相，部分癌细胞核固缩，肿瘤退行性变 较对照E组明显。各组HE染色见图1。

 3．2 裸鼠肿瘤组织hTERT蛋白表达hTERT蛋白阳性表达大部 分在胞浆，少部分在胞核，(见图2)。染色综合得分比较(见表 1)。各用药组与对照组比较，有统计学差异(P <0．05)；用药组 问两两比较，有统计学差异(P <0．05)

 3．3 裸鼠肿瘤组织Bcl一2蛋白表达Bcl一2蛋白阳性表达在胞 浆，(见图3)。染色综合得分比较(见表2)。各用药组与对照组 比较，有统计学差异(P<0．05)；用药组问两两比较，有统计学差 异(P <0．05)。

 3．4 裸鼠肿瘤组织Bax蛋白表达Bax蛋白阳性表达在胞浆， (见图4)。染色综合得分比较(见表3)。各用药组综合得分高 于对照组，有统计学差异(P<0．05)；用药组间两两比较。有统计 学差异(P <0．05)。

 3．5 裸鼠肿瘤组织凋亡指数的变化表达凋亡细胞核固缩呈圆 形或椭圆形、蓝黑色，染色体沿核膜形成半月状或新月状。部分 核凝固成致密小圆球形，(见图5)。凋亡指数的变化(见表4)， 其直方图，(见图6)。各用药组与对照组比较，有统计学差异(P <0．05)，A组与B组、A组与C组、B组与D组、C组与D组相 比，有统计学差异(P <0．01)

 凋亡指数：联合用药D组>高剂量A组>顺铂常规化疗C 组>低剂量B组>对照E组。

 3．6 裸鼠组织不同组hTERT，BC1—2及Bax染色综合得分比较 根据表1—3，将测定各蛋白表达的结果汇总，获得直方图。见 图7。

 从图7结果可知，hTERT与Bcl一2表达：联合用药D组< 高剂量A组<顺铂常规化疗C组<低剂量B组<对照E组；Bax 表达：联合用药D组>高剂量A组>顺铂常规化疗C组>低剂 量B组>对照E组。

 4 结论

 细胞凋亡(apoptosis)是细胞在一定生理或病理条件下，遵循 自身的程序，自我结束生命的过程。它是一个主动的、高度有序 的、多基因控制的、一系列酶参与的过程，BC1—2，Bax是与凋亡 最相关的调控基因。

 Bel一2最初是从人的滤泡性B细胞淋巴瘤中分离出来的， 它定位于人第18号染色体，在淋巴瘤中极易发生染色体易位t (14；18)，使Bcl一2与14号染色体上IgH基因并列导致过度表 达，是至今为止研究最深入、最广泛的凋亡调控基因之一。Bcl一 2基因表达产物是一种细胞内膜蛋白，主要位于线粒体内膜、内 质网和核膜 j。通过抵抗多种形式的细胞死亡，延长细胞寿命， 使细胞数目累积增多而促进肿瘤的形成。本实验结果显示，裸鼠 肿瘤组织空白对照组Bcl一2染色综合得分最高，随着汉黄芩素 和顺铂作用后抑瘤率的增强，Bcl一2染色综合得分下降，表明 Bcl一2与肿瘤形成有关。Bcl一2的抗凋亡机制有以下几种可 能：①Bcl一2具有膜转运功能，能抑制细胞内质网Ca 的释放， 而细胞凋亡中DNA消化需要ca 依赖性核酸内切酶参与，推测 Bcl一2可通过改变细胞器的ca“来抑制凋亡_4 J。②Bcl一2能够 抑制线粒体膜通透性转运孔开放和维持线粒体跨膜电位，进而阻 止线粒体内细胞色素C和凋亡诱导因子的释放，从而抑制凋 亡 ；③Bcl一2通过其BH 结构与Ced一4／Apaf一1结合，扣押 Apaf一1／capase一9复合物或抑制其形成，进而抑制凋亡 。本 实验发现裸鼠组织经药物作用后，随着药物抑制肿瘤作用的提 高，Bcl一2蛋白表达逐渐下调，与凋亡指数变化的表达呈相反变 化趋势，可能与汉黄芩素抑制Bcl一2基因表达有关。

 Bax是1993年克隆成功的一种基因，其翻译产物与Bcl一2 蛋白大约有2l％的氨基酸序列同源，也被称为Bcl一2家族成员 之一，其作用与Bcl一2相反，能促进细胞凋亡 7 3。Bax蛋白广泛 分布于人体许多细胞和组织中，而在多数肿瘤组织及细胞系中表 达下降 ，在肿瘤形成过程，Bax大量激活或表达，通过促进细胞 凋亡，抑制肿瘤形成。有研究发现转染Bax基因不仅可使多种细 胞发生凋亡，而且可使放射线和化疗药物等许多因素诱导细胞凋 亡 。本实验发现，随着药物抑制肿瘤作用的增强，Bax蛋白染色综合得分增加了，裸鼠组织Bax蛋白表达与凋亡指数变化的表 达呈同向变化趋势，可能与汉黄芩素促进Bax基因表达，从而诱 导了细胞凋亡有关。

 肿瘤的发生，一方面源于肿瘤细胞过度增殖，另一方面与细胞 凋亡相对不足有关。端粒酶与凋亡的关系引起了人们极大的兴 趣 。Fu争” 通过对嗜铬细胞瘤细胞PC12中的观察发现端粒 酶活性随Bcl一2表达增强而升高，Bcl一2的抑制剂可使端粒酶活 性迅速下降。张百红 等研究证明苦参碱能显著抑制SGC一 7901胃癌细胞的Bcl一2的表达；凋亡抑制基因Bcl一2能够调节端 粒酶的活性，当Bcl一2过量表达时，端粒酶活性增强；当Bcl一2表 达量下降后，端粒酶活性也下降。Mahitosh等 研究表明，抗凋亡 基因Bcl一2过度表达和凋亡基因Bax表达下降可导致端粒酶活 性显著增加。本实验也发现，经汉黄芩素作用后随着浓度增加，抑 瘤率的提高，凋亡现象逐渐明显，端粒酶hTERT蛋白、Bax蛋白表 达逐渐下调，而Bcl一2蛋白表达逐渐增强。端粒酶活性、hTERT 蛋白的下调伴随Bax蛋白表达的增强、Bcl一2蛋白表达的减弱，说 明端粒酶与凋亡密切相关。无限增殖是肿瘤细胞的生物学特征， 增殖失控关键在于端粒酶的激活；同样凋亡调控功能失调也与肿 瘤的形成有关，可以推测凋亡相关基因Bcl一2，Bax直接或间接参 与端粒酶活性的调控。下调端粒酶活性，同时也伴随细胞的凋亡， 可能是药物对端粒活性的抑制和对端粒结构的破坏，启动了凋亡 基因。然而端粒酶的活性调节是一个复杂的系统，汉黄芩素如何 抑制端粒酶活性、怎样调节凋亡相关基因如Bcl一2，Bax而发挥作 用机制仍不明确，需要我们进一步通过信号传导通路来证实。