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| 芦荟大黄素对LPS诱导的RAW264.7细胞NO生成及iNOS表达的影响 |
芦荟是一种药用价值极高的植物，传统医学用
于治疗便秘、皮炎、溃疡等，药用历史悠久。药理研
究表明 ，芦荟提取物对角叉莱胶引起的小鼠足肿
胀和嗜中性粒细胞向腹膜的迁移有抑制作用，芦荟
叶渗出液对急性和慢性炎症具有抑制作用，该作用
可能与抑制小鼠巨噬细胞一氧化氮释放有关 J。
然而，作为芦荟中含量较高且极具开发价值的生物
活性物质之一，芦荟大黄素(aloe．emodin)对炎症的作用，特别是对炎症因子影响方面的研究却少见报
道。很多慢性疾病的发病机制都涉及炎症，如炎症
性肠病、类风湿关节炎、败血症和癌症等，因此，抑制
前炎症分子的产生成为预防或治疗各种疾病的重要
靶点 。内毒素诱导的RAW264．7小鼠巨噬细胞
模型，被广泛用于研究炎症反应。巨噬细胞在外部
细菌毒素如脂多糖(LPS)等刺激时，可促使炎症介
质如NO等的分泌 J。因此本研究以LPS诱导
RAW264．7细胞释放NO为靶点，考察芦荟大黄素
的抗炎作用及机制。
1 材料
1．1 试剂芦荟大黄素购于中国药品生物制品检
定所，纯度98．3％ 。脂多糖(LPS)为Sigma公司产
品。胎牛血清、DMEM培养基均为Gibco公司产品。
TRIzol~提取试剂盒为加拿大BBI公司产品。反转
录聚合酶链反应试剂盒为TaKaRa(大连)公司产
品。引物由上海生工生物公司合成。其余试剂均为
国产分析纯。
1．2 细胞株小鼠巨噬细胞株RAW264．7细胞购
于美国ATCC公司。
1．3 仪器Multiskan Ascent酶标仪，美国Thermo
Electron公司产品。Napco 5410型二氧化碳孵箱，美
国NAPCO。PCR仪、电泳仪、电泳槽及凝胶成像仪
均为美国BIO．RAD公司产品。
2 方法
2．1 芦荟大黄素对RAW264．7细胞的毒性作用
RAW264．7细胞按2 x 10 ／孔接种于96孔板中，贴
壁4 h后，加入不同浓度(0．08～10 mg·L )的芦
荟大黄素孵育2 h，再加人终浓度为10 g·L 的
LPS刺激20 h后，每孔加入MTY(5 g·L～，PBS配
制)20 l，继续孵育4 h后弃上清，每4L~I]人100 l
DMSO，震荡10 rain，于540 nm波长处测定吸光度。
2．2 芦荟大黄素不同浓度对LPS诱导的RAW264．7
细胞释放NO的影响细胞按2 x 10 ／孔接种于96
孔板中，每孔100 l，贴壁4 h后，加入50 l不同浓
度(0．45～2．50 mg·L )的芦荟大黄素(正常对照
孔或模型对照孔加入等体积的培养基)孵育2 h，再
加入50 l终浓度为10 g·L 的LPS刺激(正常对照孔加入等体积培养基)24 h，Griess法 测定上
清中NO，一的含量，用以反映NO水平。L—NAME
(终浓度为200 mol·L )作为阳性对照药物。
2．3 芦荟大黄素不同时间对LPS 诱导的
RAW264．7细胞释放NO 的影响 实验方法基
本同“2．2”，所不同者，芦荟大黄素浓度为2 mg·
L～，加入LPS后，分别孵育4、8、12、16、20、24、28、
32 h，取上清测定NO浓度，实验重复3次。
2．4 芦荟大黄素对硝普钠释放的NO 自由基的影
响 在酶标板中每孔加入各浓度芦荟大黄素药
液和60 mmol·L。。硝普钠各75 1；，硝普钠阳性孑L
以75 l 0．I mol·L 磷酸盐缓冲液代替药液，空白
对照孔以150 txl 0．1 tool·L 磷酸盐缓冲液代替药
液和硝普钠，药物对照孔以75 l 0．1 mol·L 磷酸
盐缓冲液代替硝普钠，微型振荡器上振荡30 S混
匀，25℃ 避光反应5 h，加入100 l Griess试剂，
Griess法测定NO含量，实验重复3次。
2．5 芦荟大黄素对iNOS活性的影响 RAW
264．7细胞培养在25 cIn 细胞瓶中，待长至50％ 左
右时，更换含5 g·L LPS的培养基培养24 h，用
D—Hanks漂洗3次，刮取细胞、离心、重悬。将细胞
按2×10 个／孔浓度接种于96孔板，4 h贴壁后，给
药组加入不同浓度芦荟大黄素药液，空白对照组加
入等体积培养基，孵育8 h后，Griess法测定NO水
平。
2．6 芦荟大黄素对iNOS mRNA含量的影响
RAW264．7细胞接种于6孔培养板，给药组加入芦
荟大黄素(0．63～5．00 mg·L )，孵育2 h后加入
LPS，共同培养4 h后提取RNA。按TRIzol 抽提试
剂说明书进行。取5 l做凝胶电泳，测其完整性，
其余一80％保存备用。RT反应按试剂盒说明书进
行，得到的cDNA置于一20~C保存。PCR反应：体系
组成：ddH，0 9．5 txl，2 Z PCR master 12．5 txl，eDNA
1 l，引物1 l，混匀后短速离心，按以下条件进行
反应：预变性95℃ 7 rain，变性95℃ 40 S，退火51℃
45 S，延伸72℃ 2 rain，30个循环，最后72℃延伸10
min。结束后，产物经1％琼脂糖凝胶电泳(50 V，80
min)鉴定，用凝胶成像仪进行灰度扫描分析。iNOS
引物：sense primer：5 一CTC AGC CCA ACA ATA CAA
G一3 ，anti—sense primer：5 一CTA CAG TTC CGA GCG
TCA一3 (530 bp)；13一actin引物：sense primer：5，_TGT
TAC CAA CTG GGA CGA CA一3 ，anti—sense primer：
5 ·AAG GAA GGC TGG AAA AGA GC一3 (392 bp)。
2．7 统计学分析实验数据采用 4-S表示，用t—
test进行显著性检验。
3 结果
3．1 芦荟大黄素对RAW264．7细胞的毒性作用
芦荟大黄素浓度低于8 mg·L 时，镜下观察细胞
状态良好，与对照组相比，差异均无显著性，表明芦
荟大黄素对细胞无明显毒性(以下研究芦荟大黄素
浓度均在8 mg·L 或以下进行)。
3．2 芦荟大黄素不同浓度对LPS诱导的RAW
264．7细胞释放NO 的影响 如Fig 1所示，在lO
g·L 的LPS刺激下，RAW264．7细胞释放NO的
量增加，与对照组相比差异有显著性(P<0．01)，表
明LPS能明显诱导RAW264．7细胞释放NO，而芦
荟大黄素对激活状态RAW264．7细胞NO释放有抑
制作用，并呈良好的剂量依赖关系。
3．3 芦荟大黄素不同时间对LPS诱导的RAW
264．7细胞释放NO的影响 用2 mg·L 的芦荟
大黄素刺激RAW264．7细胞，培养4 h时，芦荟大黄
素组、LPS组、对照组中NO含量基本无变化；8 h
时，LPS组中NO含量开始上升，与对照组比较差异
有显著性(P<0．01)；随着培养时间延长，LPS组释
放的NO量继续增加，8～16 h之间升高幅度最大，
随后幅度逐渐减小，24 h后达到平台期，此时NO含
量基本稳定。芦荟大黄素组同LPS组走势相似，但
NO含量要明显低于LPS组，20 h时，芦荟大黄素组
NO含量降低，表明此时抑制作用最强，24 h后抑制
作用基本恒定，抑制率在55％ 左右。Fig 2表明在4
～ 32 h内，芦荟大黄素呈时间依赖性地抑制LPS诱
导RAW264．7细胞释放NO。
3．4 芦荟大黄素对硝普钠释放的NO 自由基的影
响如Fig 3所示，阳性组(硝普钠组)释放大量的
NO，与对照组相比差异有显著性(P<0．01)。芦荟有抑制作用，且呈明显剂量和时间依赖关系。更高
剂量的芦荟大黄素对硝普钠释放的NO含量也无影
响，表明芦荟大黄素抑制NO释放的作用不是通过
直接清除NO 自由基实现的。NOS是生物体内NO
合成的关键限速酶，内源性NO量的改变必然伴随
NOS活性或表达的变化。实验显示，芦荟大黄素对
iNOS活性无明显影响，却可抑制iNOS mRNA表达，
表明其对体系中NO的影响是通过iNOS量的变化
来实现的。
总之，芦荟大黄素可明显降低LPS刺激的
RAW264．7细胞NO释放，并呈时间和剂量依赖关
系，此作用既非直接清除NO，又非影响iNOS活性，
而是通过其抑制iNOS mRNA表达来发挥作用的。
芦荟大黄素也存在于大黄等植物中，近来发现，大黄
总游离蒽醌提取物能通过抑制IKBc~降解和NF-KB
p65核转位对抗内毒素造成的肺损伤¨ ，但芦荟大
黄素是否有此作用，以及是否还存在其他靶点需要
进一步研究。
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