关键词:人参单体Rh2 凋亡 肺腺癌细胞 细胞跨膜电位 耐药

 化疗是治疗晚期肺癌患者的重要手段，临床上化疗失败 的主要原因是肺癌细胞对抗癌药物产生耐药。寻找既能有 效克服肿瘤细胞的耐药，毒副作用又小的抗癌药物，是目前 临床上急需解决的问题。传统的中草药中不少药物因毒副 作用小且有一定的抗肿瘤作用，而日益受到研究者们的关 注。本研究拟探讨人参单体Rh2对肺腺癌A549DDP细胞的 促凋亡作用。

 1 材料与方法

 1．1 材料

 1．1．1 细胞肺腺癌A549细胞由中南大学细胞培养中心 提供；A549DDP细胞由中科院生物物理所生物大分子国家重 点实验室提供。

 1．1．2 药品顺铂(cisplatin，DDP)购于山东齐鲁制药厂，人参单体Rh2由吉林大学基础医学院生化研究室提供。

 1．1．3 试剂M’IT、Hoechst33258、Rh一123均购自si胛公司。 其它试剂由中南大学现代测试中 t5提供。

 1．1．4 仪器低温高速离心机、C02细胞培养箱、荧光显微 镜、酶标仪等由湘雅医院中心实验室提供，流式细胞仪由湘 雅医学院遗传实验室提供。

 1．2 方法

 1．2．1 DDP或Rh2对细胞的抑制率用M’IT法计算DDP或 Rh2对A549细胞和A549DDP细胞的生长抑制率(IC)。经预 实验选择0．1、1．0、10、20、50、100、5OO／nnol／L不同浓度，每 种浓度设5个复孔。根据下列公式(1)计算顺铂对细胞的半 效抑制率(‰ )，根据公式(2)计算耐药指数(R／)。将A549 DDP细胞分成2组，对照组细胞加生理盐水，实验组细胞加 入能有效抑制细胞的Rh2，作用48 h后进行后述指标检测。

 1．2．2 荧光染色观察细胞形态细胞按上述实验分组药物 干预后，消化细胞，1 000 r／rain，离心10mill，用PBS洗涤重悬。 加入60／~g／mL Hoechst33258，约10min后，荧光显微镜下观察， 拍照；计数20O个细胞，计算凋亡细胞百分率。实验重复2 次。

 1．2．3 流式细胞仪检测细胞线粒体跨膜电位(△ ) 细胞按 上述实验分组药物干预后，消化细胞，1 000 drain，离心10 mill，用PBS洗涤重悬，加入20／nnol／L的Rh123染液，37℃避 光染色30min，PBS洗涤2次，重悬后在流式细胞仪上检测细 胞△ ，激发波长488 am，吸收波长525 am。

 1．2．4 统计处理数据以均数±标准差( ±s)表示。组问 比较用单因素方差分析，用Excel软件完成统计学处理。以 P<0．05判断有统计学意义。

 2 结果

 2．1 DDP、Rh2对细胞的抑制率

 DDP作用48 h后，A549 DDP及A549细胞的‰ 分别为 325／unol／L、24／mlol／L，R／为l3．54，≤10／nnol／L的Rh2对A549 及A549DDP细胞无明显抑制作用，IC<5％(P>0．05)；当 Rh2~>20／nnol／L时，对两种细胞有明显抑制作用(P<0．05)， 且随着浓度的增加，Rh2对A549 DDP细胞的抑制率明显增 强，见图l。

 2．2 荧光显微镜观察细胞核形态

 Hoechst33258染色后，荧光显微镜下可见对照组的细胞 核圆而大，细胞核形态正常，染色质分布均匀，表现为弥散均 匀的荧光；细胞凋亡核占(6．13±0．98)％。实验组有大量固 缩变形的细胞核，染色质浓缩、聚边，表现为浓染致密的荧光 颗粒，细胞核缩小变形，有凋亡小体形成；细胞凋亡核占 (59．46±1．22)％，与对照组比较，P<0．01。见图2。

 图1 Rh2对细胞生长的抑制曲线

 图2 细胞荧光染色(X 2o0)

 2．3 流式细胞仪检测细胞线粒体跨膜电位

 对照组的A549DDP细胞△ 维持正常水平，而实验组的 A549DDP细胞△ 明显降低，在正常峰之前出现一个△ 明 显降低的新的细胞亚群(图略)，与对照组比较有显著性差 异，P<0．01，见图3。

 图3 AlI，相对值直方图

 3 讨论

 肿瘤耐药是目前临床上急需克服的难题，许多化学药物 被证实具有抗癌作用，但这些药物在体内要达到体外抗癌实 验的有效浓度需要的剂量太大，不能在临床中广泛应用。近 年来学者们发现人参提取物、人参皂苷等可以直接杀伤肿瘤 细胞。Choi等⋯研究了人参皂苷包括总苷、PI)G、PrG、Rbl、 Rb2、Re、Rgl、Rc能否提高两种急性淋巴细胞性白血病细胞 (AML一2／D100细胞和AML一2／DX100细胞)的化疗敏感性和药 物积累，发现PrG对两种细胞均有毒性。Yun_2 则通过流行 病学研究，发现高丽参可预防和抵抗非器官特异性癌症，食 用人参者患胃癌、肺癌的相关风险率(RR)降低，而这种预防 和抗癌特性主要是由于Rg3、Rg5、Rh2的作用。Yun等 研究了包括Rh2在内的4种人参皂角苷的抗癌效果，发现Rh2是 人参中抗癌的有效成分，它有降低肺癌发生率的倾向性。本 实验结果显示，A549 DDP细胞虽然对顺铂的耐药性显著强于 敏感的A549细胞，大于10tanol／L的Rh2对这两种细胞均有 明显抑制作用，且这种逆转作用呈剂量依赖性。Hoechst33258 染色后，对照组细胞核染色质分布均匀，荧光分布正常，实验 组中，A549 DDP细胞核染色质聚集增浓，荧光团块状分布，并 有特征性凋亡小体出现。说明Rh2能诱导A549 DDP细胞凋 亡，与文献报道一致。

 发掘高效低毒的抗癌剂，中草药具有极大的优势，应用 前景广阔，但中药药理作用广泛，药物成分复杂，很多中药抗 癌机制不明确。Fei等 发现Rh2能诱导恶性黑色素瘤A375 一 细胞凋亡而抑制其增殖，且呈浓度和时间依赖性，其诱导 凋亡是由Cmpme-8和Cmpase-3通路实现的，但他认为其他 凋亡通路也可能与Rh2诱导凋亡有关。周桂华等 报道Rh2 对前列腺癌PC-31Vl细胞有明显的抑制作用，而且随着Rh2 浓度的增加，其对PC-31~1细胞的抑制作用也增强，Rh2的这 种抑制作用可能是由于其抑制了肿瘤细胞的DNA复制和转 录，使肿瘤细胞的增殖减慢或停止。△ 的崩解是细胞凋亡 的特异性早期指标之一，△ 对维持线粒体功能具有重要意 义，一旦线粒体跨膜电位耗散，细胞就会释放促凋亡物质等 一系列变化，进入不可逆的凋亡过程 j。本研究中，对照组 的细胞△ 维持正常水平，而实验组的细胞△ 明显降低，与对照组比较有显著性差异(P<0．O1)。说明Rh2对A549DDP 细胞的促凋亡作用可能是通过降低乃至崩解细胞的△ 来 实现的。对于Rh2是如何由线粒体凋亡通路最终引起细胞 凋亡的，作者将作后续报道。