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| HPLC法测定大鼠血浆中橙皮素和柚皮素的浓度 |
橙皮素(hesperetin)和柚皮素(naringenin)属于双氢黄
酮类化合物，具有抗氧化、抗肿瘤的作用，并能增加其他药物
的生物利用度 0 。目前文献口 报道HPLC法测定其血药
浓度，均采用固相萃取法处理血样。本研究采用 一葡萄糖
醛酸酶和磺酸酶水解血样，以乙醇和二氯甲烷提取，本法可
用于橙皮素和柚皮素的药动学研究。
1 仪器与试药
1100型高效液相色谱仪，包括真空脱气机、双泵、自动
进样器、柱温箱、uV检测器及ChemStation色谱工作站(Agilent
公司)。
橙皮素对照品；柚皮素素对照品；B-葡萄糖醛酸酶(IX—
A，1 660 u·mg～，批号016K8614)、磺酸酶(H～，20 u·
rIlg一，，批号087K3810)均为Sigma公司产品。甲醇为色谱
纯；水为自制双蒸水，其他试剂均为分析纯。
雄性SD大鼠，280～320 g，上海斯莱克实验动物责任有
限公司提供，许可证号：SCXK(沪)2003-0003。
2 方法与结果
2．1 色谱条件
色谱柱：Cl8柱(150mm×4．6mm，5trm)，流动相：甲醇
一20mmol·L 磷酸二氢钾缓冲液(以磷酸调至pH 2．0)梯度
洗脱(0～8 min，40：6O一50：50；8—16 rain，50：50～60：40；16
— 20min，40：6O)；检测波长288 nln；流速1．0 ml·min～；柱温
35℃ ；进样量1O 。
2．2 溶液配制
2．2．1 对照品溶液 精密称取橙皮素和柚皮素对照品各
25 mg，分别置25 Inl量瓶中，以甲醇溶解并定容，制成1 mg·
lll 的对照品贮备液。用甲醇分别稀释，制成0．5，1，5，10，
50，125，250p,g·ml 的系列浓度工作溶液，4℃保存。
2．2．2 酶溶液 精密称取B-葡萄糖醛酸酶5 mg，精密加磷
酸盐缓冲液(200 mmol·L 磷酸二氢钾溶液，用0．2 mol·L
氢氧化钠调至pH 6．8，PBS)10 ml，制成浓度为0．5 mg·ml
(830 u·ml )的B．葡萄糖醛酸酶溶液。精密称取磺酸酶
200 mg，加入PBS 5 ml，制成浓度为40 mg·ml (800 u·
rnl )的磺酸酶溶液。
2．3 样品处理
精密吸取血浆50 ，加入PBS 50td，混匀后加入p·葡萄
糖醛酸酶溶液和磺酸酶溶液各50 l，混匀，37~C保温4h后冷
至室温，加入乙醇200 l，振摇，再加入二氯甲烷600 ，振
摇30 8，30Or,min～，离心10 min，取有机层600 l，45℃氮
气吹干，残余物用流动相(40：60)100 Ixl溶解，待测。
2．4 系统适用性试验
空白血浆、空白血浆加橙皮素和柚皮素(均为0．05 Ixg·
Inl )及大鼠给药后血样的色谱图见图1。橙皮素和柚皮素
的保留时间分别为12．3和11．0 min，分离度良好，内源性物
质不干扰测定。
2．5 线性关系考察
取大鼠空白血浆，分别加人橙皮素和柚皮素的系列浓度
工作溶液，制成浓度为0．05，0．10，0．50，1．00，5．00，12．
5O，25．0o g·ml 的血浆样品，照“2．3”项下方法处理后进
样。分别以橙皮素和柚皮素的峰面积A为纵坐标，浓度c
为横坐标，进行线性回归，橙皮素和柚皮素的回归方程分别
为：A=16．792C+0．394，r=0．999 0和A=16．974C+0．214，
r=0．999 0。结果表明橙皮素和柚皮素均在0．05～25．00t~g
·TrIl 范围内线性关系良好。
2．6 精密度和稳定性试验
取大鼠空白血浆，加入适量橙皮素和柚皮素对照品溶液，
制成浓度分别为0．05，1．00，25．001xg·ml 的低、中、高浓度血
样，按“2．3”项下方法处理后进样测定。一日内测定5次，连
续测定5d，橙皮素和柚皮素的日内、日间RSD均小于10％。
同上配制低、中、高浓度(0．05，1．00，25．000~g·ml )血
样，于一40℃ ～室温冻融1、2次、室温下放置4 h、一40oC保存
4周、37℃保温4 h及样品处理后室温放置24 h，结果橙皮素
的RSD分别为3．73％ ，4．84％ ，l0．90％ ，6．88％ ，7．81％ 和
l1．62％ ，柚皮素的RSD分别为6．81％ ，4．88％ ，4．95％，
4．42％和6．49％ ，表明样品在上述情况下均稳定。
2．7 回收率试验
同上配制低、中、高浓度(0．05，1．00，25．001~g·ml )血
样，按“2．3”项下方法处理后进样测定。记录色谱图，将样
品峰面积代入随行标准曲线方程，计算所得的浓度与理论浓
度的比值即为相对回收率。计算所得的浓度与相应浓度对照品溶液的比值即为绝对回收率。橙皮素和柚皮素相对回
收率分别为96．1％ ，104．8％ ，99．9％和104．3％ ，102．2％ ，
97．7％ ，绝对回收率分别为87．4％ ，90．5％ ，84．4％ 和88．
6％ ，87．6％ ，82．5％ 。
2．8 药动学试验
12只SD大鼠随机分为2组，每组6只，给药前禁食
12h，不禁水。两组大鼠分别灌胃给橙皮素和柚皮素(20 mg·
kg )，分别于给药后0，0．25，0．5，1，2，3，4，5，6，8，10，12，24
h眼眶取血0．3 ml，肝素抗凝，3 O00r·min 离心1O min，分离
血浆，一40℃保存待测。药一时曲线见图2，利用DAS Version
1．0药代动力学参数计算程序，采用非房室模型计算出主要
药动学参数，结果见表1。
3 讨论
黄酮类化合物体内多以结合形式存在，橙皮素和柚皮素
在体内大部分以苷元形式与葡萄糖醛酸等结合 J，故一般采
用水解法分离血浆中的苷元。参照文献 “J，尝试了盐酸水
解法和B．葡糖醛酸苷酶与磺酸酶水解的方法，结果显示橙
皮素和柚皮素在酸性条件下不稳定，而在本试验所用酶水解
条件下，橙皮素和柚皮素均较稳定。
生物样品预处理方面，曾尝试黄酮类化合物经典的乙酸
乙酯液液萃取，发现回收率低。用乙醇沉淀蛋白后，再加入
二氯甲烷，使水相和有机相分层，从而有利于浓缩样品提高
分析方法的灵敏度。
大鼠灌胃给药后，橙皮素和柚皮素的吸收均很快，药时
曲线存在多个吸收峰现象。考虑可能的原因为肝肠循环等，
其机制有待进一步研究。
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