关键词:柚皮素 糖苷转移酶 转甲基酶 羟化酶 黄酮合酶

 Research Progress on Structure Modification of Naringenin with Enzymatic Method

 Abstract:Naringenin showed wide biological activities,however, the water-solubility of naringenin was poor. Kinds of enzymes in plant have the acitivity on naringenin, and the productions can increase water-solubility, enhance bioavailability, strengthen or increase the bioactivity. The research progress on sources,catalysis mechanism, application and study level of the enzymes with acitivity on naringenin is reviewed.

 Key words:naringenin; glucosyltransferase; methyltransferase; hydroxylase; flavone synthase

 近年来随着研究方法和技术的不断提高，发现 了许多新的黄酮种类和生理作用，特别是抗自由基、 调节血脂、抗癌、防癌等方面的作用，使黄酮的研究 进入了一个新的阶段，掀起了黄酮研究、开发利用热 潮。柚皮素是一种生物类黄酮，其结构图如图1所 示。它具有降血糖、抗肿瘤 J、预防和治疗肝病、抑 制血小板凝结[引、抗粥样动脉硬化[0]等作用，可被广 泛地应用于医药、食品等领域。但是柚皮素水溶性 较差，生物利用度小，在某些酶作用下对柚皮素进行 结构修饰后能够增加其水溶性、提高其生物利用度， 甚至可以增强或者增加生物活性。如糖基化后的柚 皮索具有防紫外线辐射、抗粥样动脉硬化等作用，并 且可以作为昆虫的产卵刺激物和色素[ ；烷基化的 黄酮具有更强的抑菌效果，是一类很好的植物抗毒 素 J，在木质化过程中也具有重要的作用；柚皮素不 同位点的羟基化作用能够使花的颜色发生改变。本 文拟对植物体内对生物类黄酮之_一——柚皮素具有重要代谢功能的四种酶的来源、作用机理、分子生物 学研究概况及应用进展综述如下。

 图I 柚皮素的结构图

 Fig．I Structure ofnaringenin

 1 糖苷转移酶

 天然的类黄酮糖苷分布于植物中，并且显示了 一系列的生物活性，如止咳化痰、防紫外线辐射、抗 粥样动脉硬化等，并可以作为食品添加剂，昆虫的产 卵刺激物以及色素，对心脑血管疾病有很好的疗 效 J，被广泛的应用于食品、医药、农业等领域。上 世纪三十年代以来，人们致力于石炭酸羟基的糖基 化研究。但是，许多糖基化的研究都限制于7位上 的单糖化_7]，除此之外，只有少数几篇关于4位羟基 糖基化的报道.

 柚皮素在水中的溶解度很小，生物利用度不高，而其相应的配糖物具有较高的溶解度和生物利用 度。最近研究 9表明小肠中的细胞具有将单糖苷降 解成相应的糖苷配基即柚皮素的生物活性，此外还 具有葡萄糖酸化酶的活性，能够将其转化成柚皮素 葡萄糖酸。而口服柚皮素及柚皮素单糖苷以柚皮素 和柚皮素葡萄糖酸的形式被生物体吸收。给小鼠分 别口服或者静脉注射相同剂量的柚皮素和柚皮素单 糖苷，最终在尿样中发现，使用柚皮素单糖苷时柚皮素、柚皮素葡萄糖苷和柚皮素单糖苷的总量比使用 柚皮素要多得多，这可能是由于它们的水溶性不同 所引起的。

 在很多柑桔属、矮牵牛花、金鱼草等植物中含有 葡萄糖转移酶【10]，可以将葡萄糖分子转到柚皮素的 7_位上而形成柚皮素单糖苷，尤其是在未成熟的柑 桔属植物及其种子中，含量较多。除了含有葡萄糖 苷转移酶，有些植物还含有鼠李糖转移酶，能够在柚 皮素单糖苷的6位或者2位上再引入一个鼠李糖分 子，形成芸香糖苷或柚皮苷。在柚皮素的3个羟基 中，7位羟基具有最好的亲核性，因此柚皮素糖基化 一般发生在7位上。

 1986年，Efmim Lewimohn等_1 ]发现柚子树细胞 在培养过程中能够将外源的柚皮素和橙皮素转化成 其相应的单糖苷和双糖苷，研究结果表明生成单糖 苷的作用位点在7位。1988年，他们研究n2]认为未 分化的酸的柑桔子中也含有能够将柚皮素转化为单 糖苷和柚皮苷的酶，而且其作用原理是首先将葡萄 糖转入到7位上，而后在该葡萄糖分子的6位上以 6，l糖苷键再接入一个鼠李糖分子。

 1989年，Cecilia A．McIntosh等_10]从柑桔属植物 柚子树的树苗中提取了UDP-葡萄糖转移酶，其中以 树叶中含量最高。该酶对柚皮素具有催化活性，能 够在其7位上转入一个葡萄糖分子，将其转变为柚皮索单糖苷。它的最适pH是6．5～7．5，最适温度 是37℃，表观米式常数Km为O．08 mM。

 2004年，Sakakihara等【14J从金鱼草、矮牵牛花中 都获得了能够编码葡萄糖转移酶的基因，该酶能够 将糖基转移到柚皮素、毛地黄黄酮等类黄酮上，但是 其对柚皮素的催化活力比较低。将所述基因转入到 没有该基因的植物中，获得了一种含有黄色色素的 黄花，而且该基因能够在植物中得到稳定的表达。 Sakakibara等已经在美国申请了该项专利。

 2 转甲基酶

 目前研究较多的柚皮素烷基化主要为甲基化r15]，另外还有十六烷基化等。酶法烷基化一般也 都发生在羟基上【15]，8位等无羟基位点也可发生甲 基化，但是一般都是利用化学催化的手段【16J。烷基 化的类黄酮具有多种生物活性，如具有更强的抑菌 效果n 、在木质化过程中具有重要作用等，而且酶 法烷基化类黄酮已经发展到分子水平.

 樱花素是一种很好的植物抗毒素，它可由在柚 皮索的7一位上通过转甲基酶转入一个甲基而形成。 植物抗毒素是植物受到外界病原微生物侵扰后所产 生并积累的一类具有抗菌活性的小分子物质，樱花 素是从水稻稻瘟病感染组织中分离鉴定的一种黄烷 酮类植物抗毒索，尽管植物抗毒素在植物体内含量 很低，但它们所表现出的独特的抗菌活性，是植物防 御体系的重要组成部分。樱花素的抑菌效果比柚皮 素要好得多[17]，姜晓华等[19]认为造成这种差别的 原因可能是柚皮素的7。位甲基化而转化为樱花素后 提高了分子疏水性的缘故。在樱花素的合成过程中 转甲基酶是一个关键酶，其活力的大小将会直接影 响樱花索的合成。茉莉酸及其部分氨基衍生物具有 诱导7．转甲基酶的活性，其结构如图2所示.

 图2 茉莉酸及其氨基酸衍生物的结构图

 Fig．2 Structures ofjasmonic acid and its amino acid conjugat

 以上这些物质的(+)．对映体和单独的氨基酸 都没有诱导7一转甲基酶的活性。(2)和(3)具有较高 的诱导7一转甲基酶的活性而其危害植物的毒性却很 小。(1)是一种高柔韧性的小分子物质，便于其与多 个受体相互作用，具有多种生物活性，如危害生物毒 性、植物抗毒性。相反的，(2)和(3)则具有刚性的和 适合的构型，只与目标接收位点结合，以便于樱花素 的合成。(5)具有较低的诱导活性，它可能是一种不 活泼的茉莉酸的储备形式。

 3 羟化酶

 目前已知有多种羟化酶可对柚皮素进行羟基 化，如3，．羟化酶、3，，5，一羟化酶[驯、3-~gN[ ¨，它 们分布于柑桔属、金鱼草属、矮牵牛花、欧芹等植物中.

 3．1 3 一羟化酶(F3 H)和3 。5 ．羟化酶(F3 ，5 H)

 3 ．羟化酶和3 ，5 一羟化酶是两种细胞色素酶， 它们能够在NADPH和o2存在的情况下分别使黄 酮、黄酮醇、黄烷酮、黄烷酮醇的3 一位点和3 ，5 一位 点发生羟基化反应。B环上羟基的数量能够影响类 黄酮的颜色，这些羟化酶在细胞色素形成过程中是 限速酶。所以在一些植物中，这些羟化酶的活性将 会直接影响到这些植物的花的颜色[22]。Tor~ia花 中，若降低植物中3 ，5 一羟化酶的含量，花的颜色将 会变浅，若增加3 一羟化酶的含量，花的颜色将会变 成红色，如图3所示.

 图3 Torenla花的的颜色随植物中羟化酶基因表达量的 变化情况

 其中，(3a)左边～株为野生型的Tca~ia花(SWB)，中间的一 株为野生型的Torenia花经处理后F3 ，5’H基因表达被抑制的花 (SWBTHF／20-52)，右边的一株为SWCB’rHF／20-52经处理后乃 H 基因得到大量表达的花( B5牾，20_52)；(3b)Torenia花经处理后 中花色素含量的变化情况，兰色的指花翠素型花色素，红色的指 花青素型花色素，黄色的指花葵素；(3c)表示T,mmla花经处理后 黄酮含量的变化情况，左边的表示洋芹素，右边的表示毛地黄黄 酮。

 3a)the phenotypic chang~ 0f flowers．L ，8 wild type flower (SWB)．Center。aflower sWm’HFI20-52 generated by co-suppressing F3’，5’H 0fSWB．Right，aflower 0f劬1 c SWB548／20-52 OVCr-C~一 pressingF3’H eDNAin SWBTHFI20-52．(3b)Amount 0f anthocyanins 0f佃ms目呵lic tol~ a flower．I)el，delphinidin，petunidin and malvidin； C ，cyaniding md peonidin； Pel。pdargcnidin．Cya~din-type antho— cyanidins inemssed in SWB548／20-52．(3c)Amount of flavones of a 协蝴sgeIIictomniaflower．

 由上图可知，F3 ，5 H基因表达量的减少能够 使Torenia花中花翠素型花色素含量大大减少，并且 能够使花青素型花色素含量增加，而对洋芹索和毛地黄黄酮几乎没有影响。在SWBTHF／20—52花型的 基础上F3 H基因表达量的增加能够进一步增加花 青素型花色素的含量，毛地黄黄酮含量也有所增加， 相反洋芹素含量则降低了。Torenia花中F3 H和 F3 ，5 H基因表达量的变化引起了各种色素含量的 变化，而最终导致了花颜色的变化。

 Yukiko Ueyama等[加_从分子水平对3 一羟化酶进 行了研究，3 一羟化酶的氨基酸序列的检测率已经达 到了80％以上，表达3 一羟化酶的基因也已经从tore— nia、矮牵牛花和阿布属中分离得到，并且能够在酵 母细胞中得到很好地表达。他们认为[20]3 一羟化酶 具有一般细胞色素合成酶P450的通性。3 一羟化酶 在N一末端具有一个富含脯氨酸的疏水区域，这个区 域就像一个铰链可用予最佳定位以及酶作用时目标 的锁定。3 ．羟化酶还包括了一个苏氨酸末端，它用 于固定催化时所需的氧分子。

 3．2 3一羟化酶

 在植物体内有两种3一羟化酶，即flavanone 3 一 hydroxylase(FlIT)和flavonol synthase(FLS)o FHT只是 3一羟化酶，而FLS还能够将黄烷酮醇进一步转化为 黄酮醇，而且其底物特异性也有所不同，FHT只对 (2Is)．柚皮素具有活性，而FLS对(2Is)一和(2 )一柚皮 素都有活性，其催化柚皮素的反应过程如图4.

 图4 两种3一羟化酶(r~rr和F )催化柚皮素的反应过程 Fig．4 Reactions in the naringenin pathway catalyzed by tta— vanone 3b-hy出咖(FHT)and flavonol synthase (ns)

 已有报道[23 称，从柑橘属、未成熟的欧芹叶子、 矮牵牛花中都可得3．位羟化酶nrI‘的eDNA，并且 在大肠杆菌Escherichia coli和酵母中得到了表达，其重组蛋白也被分离纯化，用于对底物柚皮素的转化。 FLS的cDNA也已经从欧芹等植物中获樽，其重组蛋 白显示它与其他过氧化酶有5o％的的相}以性。

 4 黄酮合酶

 催化脱氢作用的黄酮合酶有两种，即flavone synthase I(FNS I)和flavone synthase II(FNSⅡ)。 FNS I存在于欧芹等伞形科植物中，它是一种可溶 性酶，其催化活性依赖于2一酮戊二酸的存在，它是一 种能够将2，3。邻位的氢原子直接脱去的过氧化酶。 FNSI的cDNAs已经从石芹的四个生长阶段中获 得[24]，并且在酵母细胞1NVScl中得到了表达。FNS Ⅱ是一种细胞色素合成酶，它的活性不依赖于2．酮 戊二酸，而需要NADPH和02的存在。二价铁离子 和三价铁离子是FNSⅡ的抑制剂。在1999年，FNS Ⅱ的cDNAs已经从大丁草、金鱼草属植物、蓝猪儿 (属玄参科植物，是一种优良草花)中克隆得到，并且 在酵母细胞中得到了表达.

 除此之外，自然界还存在多种酶能够对柚皮素 进行结构修饰，如能使柚皮素2位上苯环发生转移 的酶[26]、卤化酶[27】、使其与金属离子螫合的酶[矧、8 位异戊二烯化酶等等，这些酶对柚皮素发生作用后 的产物能够增强或增加柚皮素的生物活性，而其中 一些酶的性质及其产物的作用都还需要进行进一步 的研究。