1 材料和方法

 1．1 试药

 Naringenin(4’，5,7-trihydroxyflavanone)，(含量为95％ ， Sigma，083K1328)；内标懈皮素(Quercetin)(含量为98％， Sigma，113K1051)。乙腈(美国Honeywe~&Jackson公司， HPLC级)；甲醇(德国Merck公司，HPLC级)。Waters OASISTM C．。固相提取柱(1cc，W1194J3)。其余试剂均为国 产分析纯。水为自制超纯水(法国Millipore，Milli—Q型超纯水机)。

 1．2 仪器

 Waters高效液相色谱仪(600型低压梯度泵．717型自 动进样器，486型紫外检测器，Mil／ennium 色谱工作站)； XW一80A旋涡混合器(上海医科大学仪器厂)：水浴恒温振 荡器(SHZ—C型，上海跃进医疗器械厂)；高速离心机(美国 雅培公司TDx仪附件)；无油真空泵(美国GAST公司生 产)；ORION 710A型pH／ISE计。Hypersil BDS Cl8分析柱 (25o mmx4．6 mm，5 g．m)，ODS保护柱(zo rfllnx4．6 rfln，5 Ixm)。

 1．3 色谱条件

 流动相由乙腈：磷酸水溶液(pH 2．5)=(33：67，V／V)混合 组成。pH 2．5磷酸水溶液由磷酸滴加入蒸馏水调节pH至 2．5而得，经O．45 m水系滤膜抽滤备用。流速1．0 mL／min， 紫外检测波长288 nm，柱温为室温。

 1．4 标准溶液配制

 1．4．1 柚皮素标准溶液配制精密称取柚皮素适量，以甲 醇溶解并定容，制得浓度为1 mg／mL的柚皮素标准储备液。 将柚皮素标准储备液以甲醇稀释．配制浓度分别为1、2、 1O、20、100、200 I．Lg／mL的柚皮素标准溶液．于冰箱中一2O℃ 保存备用。

 1．4．2 内标液配制取内标槲皮素适量，置于10 mL容量 瓶中，以甲醇溶解并定容，得浓度为1 I．Lg／mL的内标液。于 冰箱中-20％保存备用。

 1．5 柚皮素与内标的稳定性

 1．5．1在不同pH值溶液中的稳定性按中国药典2000版 制备pH 3、4,5⋯6 8 7．4的缓冲液，并用pH计校准。

 取柚皮素和内标标准溶液分别用上述缓冲液配制浓度 为1 mL溶液，漩涡10 s混合后，进样100 ，每个pH 进样3次，以峰面积变化表示含量变化。

 1．5．2 在37℃水浴中稳定性考察取1 I．Lg／mL柚皮素和内标标准溶液适量分别放入15支10 mL圆底玻璃管中．封 口，置37~C水浴中，而后分别于0，30，60，90，120 min取样， 每次取3管，每管进样100 L，以峰面积变化表示含量变 化。

 1．5．3 在血浆中稳定性将柚皮素标准和内标溶液加入血 浆配置为10~g／mL，漩涡混合后置37~C水浴中，而后分别 于0，30，60，120 min取样，每个时间点各取3管．按样本处 理方法项下操作，以柚皮素和内标各自的峰面积变化表示 含量变化。

 1．6 样本处理

 取大鼠血浆100 ，置1．5 mL塑料离心管中，加入20 pH 4．5醋酸溶液漩涡混合10 s，再加入内标溶液20 漩涡混合30 s后加入蛋白沉淀剂(甲醇：pH 2．5磷酸溶液= 30：70，V／V)混合溶液1 mL，漩涡10 s，10 800 r／min离心5 min。吸取上清液，加入经1 mL甲醇及1 mL pH 2．5磷酸缓 冲液活化的Water OasisTM HLB固相提取柱。待抽干后加入1 mL甲醇：pH 2．5磷酸缓冲液=(50：50，V／V)混合溶液淋洗， 弃掉洗出液，抽干以除尽残留液体．而后用1 mL甲醇淋 洗，收集洗出液，以氮气吹干。残渣加入200 甲醇：pH 2．5磷酸缓冲液=(50：50．V／V)混合溶液漩涡混合30 s使溶 解，10 800 r／min离心5 min，取上清液100 进样，记录色 谱图，以柚皮素峰面积(A )与内标峰面积(A。)之比y代入 标准曲线计算柚皮素血浆浓度。

 1．7 血浆标准曲线制备

 精密量取样品血浆100 ，置1．5 mL塑料离心管中， 分别加入不同浓度的柚皮素标准溶液10 ，使其终浓度 分别为0．05、0．1、0．5、1、5、10~g／mL。按样品处理方法操作， 以不同浓度柚皮素系列溶液的柚皮素峰面积(A )与内标峰 面积(A )之比Y(Y=A,CA )为纵坐标，柚皮素浓度为横坐标 作标准曲线

 1．8 回收率及精密度

 分别于100 g．L空白血浆中加入低、中、高浓度的柚皮素标准溶液10 ，混匀，使其终浓度分别为0．1、1、10 mL(n=5)，按样本处理方法项操作，将柚皮素(A )与内标峰 面积(A。)之比y代入标准曲线计算柚皮素浓度，以测得值 与加入值之比计算方法回收率，并计算日内精密度。以每天 1次，连续5 d测定的柚皮素3个浓度计算日间精密度。

 2 结 果

 2．1 色谱行为

 在本方法的预处理和色谱条件下．血浆中内源性杂质 不影响柚皮素与内标的分离测定，血浆中杂质、内标和柚皮素都能很好的分离。内标与柚皮素的保留时间分别为7．6 min和11．6 min，两者分离完全，峰形良好，无杂质峰干扰。 空白血浆及血浆样品色谱图见图2。

 柚皮素在0．05～10 tLg／mL浓度范围内，血药浓度与峰 面积比有良好线性关系，其回归方程为：Y=1．9197C+ 0．0681，r=0．9998。

 2．2 柚皮素与内标的稳定性

 2．2．1 在不同pH值溶液中的稳定性实验结果如图3所 示，由此可见，柚皮素在pH 4．0～7．4含量基本不变，即其在 pH 4．0～7．4范围内受酸碱性的影响不大 从内标的曲线可 知．其在pH 4．0～5．0范围内较稳定；而在pH 5．0～7．4．其含 量下降幅度较大，说明内标在此pH范围内不太稳定。由此 可知，为保证内标的含量稳定不变．实验应在pH 5．0以下 环境中进行。

 2．2．2 在370c水浴中的稳定性柚皮素与内标在370c水 浴中的稳定性的实验结果如图4所示，虽然以百分比表示 含量变化的曲线波动较大，但以柚皮素峰面积(A )和 Quercetin峰面积(A。)计算含量变化的相对标准偏差 (CV％)分别为3．0％和2．7％，均小于5％，可见柚皮素和内 标在370c水浴中较稳定。

 2．2．3 在血浆中的稳定性柚皮素与内标在血浆中的稳 定性的实验结果如图5所示，由此可见柚皮素在加入醋酸 的血浆中仍然稳定，含量不会随时间的延长而减少。与此 同时．内标的含量则随着时间的增长而不断降低，这说明 虽然血浆已经进行酸化处理，但可能醋酸的量不足或是酸 性不够强，使血浆pH仍然在足以使内标含量随时问增加而逐渐降低的水平：也可能是血浆中存在某种可使内标含 量随时问增加而降低的未知物质。因此，为保证内标含量 在实验过程中的稳定，应尽快上柱，使内标与血浆分离，减 少其受血浆影响的可能性。

 2．3 回收率及日内、日间精密度

 10、1、0．1 p,g／mL 3种浓度的方法回收率和日内及日间 RSD见表1。

 3 讨论

 本文建立了大鼠血浆柚皮素浓度的测定方法。在实验过程中，我们尝试了多种提取办法，如加入丙酮I21或蛋白沉 淀剂(5％硫酸锌溶液：甲醇，30：70，v／v)沉淀血浆蛋白后直接 取上清液进样。但这些方法的回收率不高，且有杂质干扰。 Waters Oasis Hydrophilic．Lipophilic Balance(HLB)固相提取 小柱是由亲水的N一乙烯吡咯烷酮和亲脂的二乙烯基苯按 一定比例制成的一种大孔共聚物。表面积比Waters常规的 Bond Elut C 固相提取小柱大2-3倍。它的主要优点是可 同时提取不同极性的化合物；在固相提取过程中HLB小柱 可以干燥，操作较方便，而Bond Elut C， 小柱则必须保持湿 润。因而Waters HLB固相提取小柱适合于提取血浆中的柚皮素。

 本文采用固相提取法测定血浆中柚皮素浓度。方法灵 敏。操作简单快速，可适用于柚皮苷或柚皮素后的药物代 谢动力学和药物相互作用研究。