采用测定替代对照品相对于对照品的“相对校 正因子”的方法，用替代对照品结合校正因子的方 法进行药品含量测定 J。计算 值的公式为：

 式中A 为替代对照品的峰面积；A 为对照品的 峰面积；Ci为替代对照品的浓度；C 为对照品的浓 度。

 在一定的色谱条件下，配制一系列浓度对照品 和替代对照品的溶液，以浓度为横坐标，以峰面积A 为纵坐标，分别测定对照品和替代对照品的标准曲 线，将标准曲线的截距校正为0后，用两条标准曲线 斜率 的比值求得校正因子 。测定样品时，用 A 对照品进行测定，被测样品浓度c =— ；用替代 n r／ b A 对照品进行测定，被测样品浓度C：= × ；式中 n ／ A+为被测样品峰面积。

 石杉碱甲是一种高效乙酰胆碱酯酶抑制剂，具 有提高记忆效率的功能，是治疗老年痴呆症的一个 药物，具有促进记忆再现和增强记忆保持的作用， 《中国药典》二部2005版有收载 ，已有高效液相 的含量测定方法，但石杉碱甲对照品昂贵，检验成本 很高。本实验运用替代对照品的思路，在高效液相 色谱仪上研究了用替代对照品西咪替丁测定石杉碱 甲片中石杉碱甲的含量以及该方法在药品质量控制 中的可行性。

 1 仪器与试药

 1．1 药品及试剂

 石杉碱甲对照品(批号100243-200401，含量 100．0％ ，中国药品生物制品检定所)；西咪替丁对 照品(批号100158-200204，含量100．0％ ，中国药品 生物制品检定所)，磷酸二氢钾为分析纯；乙腈为色 谱纯；水为纯化水；石杉碱甲片(规格：0．05 mg，批 号：031001，041001，050102；河南竹林众生制药股份 有限公司豫中制药厂)。

 1．2 仪器

 岛津LC2010A高效液相色谱仪(色谱仪1)； Water2690-2487高效液相色谱仪(色谱仪2)；Agi— lentl100高效液相色谱仪(色谱仪3)；Agilentl100 高效液相色谱仪(色谱仪4)；岛津LC2010C高效液 相色谱仪(色谱仪5)；色谱柱：Agilent Zorbax(色谱 柱1)SB—C18(4．6 mm×250 mm，5 p,m)PN： 880975~02 SN：USCL010716；依利特(色谱柱2)，填 料：Hype~il ODS2(4．6 mm ×150 mm，5 p,m)，柱号： E1418085，批号：5＼120＼6491；SHISEIDO FI— NEcHEMIcALS(色谱柱3)capce11 Cl8(4．6 mm × 250 mm，5 p,m)Cat．No90104；依利特(色谱柱4)，填 料：Hype~il ODS2(4．6 mm ×150 mm，5 p,m)，柱号： E1418086，批号：5、120＼6491；Inertsil(色谱柱5) ODS-3(4．6 mm ×250 mm，5 p,m)C／N：5020~1732 S／N：5FI86062；SHIMADZU(色谱柱6)Shim—pack VP—ODS(4．6 mm × 150 mm，5 p,m) Serial No： 4042093。

 2 方法与结果

 2．1 测定波长的选择

 以流动相为溶剂在190—400 nm内扫描，测得 石杉碱甲和西咪替丁紫外吸收图谱，根据对照品和 替代对照品的紫外吸收图谱选择测定波长。

 石杉碱甲和西咪替丁紫外吸收图谱见图1。可 以看出石杉碱甲对照品和西咪替丁替代对照品的紫 外吸收图不同，我们选择石杉碱甲对照品最大吸收 波长310 nm处和西咪替丁替代对照品的最大吸收 波长220 nm处作为检测波长，采用双波长检测进行 含量测定。

 2．2 色谱系统和条件

 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈一磷酸 盐缓冲液(取磷酸二氢钾2．72 g，加水1 000 mL溶 解，用磷酸调节pH 2．5)10：90为流动相；流速：1．0 mL·min～；柱温35℃ ；进样量：20 jxL；石杉碱甲检测波长为310 Hill；西咪替丁检测波长为220／I1TI。理 论板数按石杉碱甲峰计算应不低于2 000。

 2．3 溶液的配制

 2．3．1 对照品溶液的配制 精密称取石杉碱甲对 照品10 mg置50 mL量瓶，用0．01 tool·L 盐酸溶 液溶解并定量稀释制成每1 mL中约含0．2 mg的溶 液，备用。

 2．3．2 替代对照品溶液的配制 精密称取西咪替 丁替代对照品约16 mg置200 mI 量瓶中，用流动相 溶解并定量稀释制成每1 mL中约含0．08 mg的溶 液，备用。

 2．3．3 标准溶液的配制精密量取“2．3”两种备 用溶液各5 mL置10 mL量瓶中混匀，得到含石杉碱 甲对照品0．1 g·L 和替代对照品西咪替丁0．04 g·L 的溶液；再精密量取5 mL置10 mL量瓶中， 加流动相定容，得到含石杉碱甲对照品0．05 g·L 和替代对照品西咪替丁0．02 g·L 的溶液，同理稀 释得到含石杉碱甲对照品0．025，0．012 5， 0．006 25，0．003 1 g·L 和对应替代对照品西咪替 丁0．01，0．005，0．002 5，0．001 25 g·L 的溶液。 用于石杉碱甲对照品和西咪替丁替代对照品标准曲 线的测定，进一步求得厂值。

 2．3．4 供试品溶液的配制取石杉碱甲片20片， 精密称定，研细，精密称取适量(约相当于石杉碱甲 250 g)，置25 mL量瓶中，加0．01 tool·L 盐酸溶 液适量，超声处理使石杉碱甲溶解，用0．01 tool· I 盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，作为供试品溶 液。精密量取供试品溶液20 I ，注入液相色谱仪 用于石杉碱甲片含量测定。

 2．4 f值测定及其测定方法的耐用性考察

 取“2．3．3”标准溶液，按．厂测定方法测定校正因 子{

 在测定．厂值的过程中，重点考察了其耐用性 ， 即测定条件有小的变动时，考察测定．厂值受影响的 程度。液相色谱法中典型的变动因素有：流动相的组成比例和pH值、不同厂牌或不同批号的同类型 色谱柱、柱温、流速、检测器的波长和不同的色谱仪； 根据各个条件下存在误差的范围和具体情况，固定 其他条件，改变其中一个条件，考察对测定I厂值的影 响。

 2．4．1 不同品牌或不同批号的同类型色谱柱对l厂 值测定的影响．厂值测定时会用到不同品牌或不同 批号的同类型色谱柱，用Agilentl100同一台高效液 相色谱仪，分别用4根不同品牌或不同批号的同类 型色谱柱测定石杉碱甲对照品的校正因子．厂，结果显 示，更换色谱柱(长短不同、厂家不同和新旧不同)， 对石杉碱甲对照品的校正因子厂影响不大，RSD为 1．4％ 。

 2．4．2 仪器波长XCf值测定的影响HPLC紫外 检测器的波长可能存在偏差，国家计量局的仪器鉴 定规程中限定HPLC紫外检测器的波长示值误差为 ±2 Bill。在液相色谱仪上分别在308，310，312 nm 波长处测定石杉碱甲对照品和218，220，222 nlH波 长处测定替代对照品西咪替丁的标准曲线的斜率 K，计算校正因子．厂，结果显示，测定波长在310和 220 nlll处变化±2 I1II1，对石杉碱甲对照品的校正因 子厂影响不大，RSD为1．4％ 。

 进一步考察在314，306 H1TI测定石杉碱甲对照品和在224，216 11113下测定替代对照品西咪替丁的 标准曲线的斜率K，计算校正因子．厂，考察波长变化 对．厂值的影响，结果显示，测定波氐在310和220 nm 变化±4 nln，对石杉碱甲对照品的校正因子．厂影响 不大，RSD为1．3％ 。

 2．4．3 流动相流速XCf值测定的影响HPLC泵的 流速可能存在偏差，药品检验仪器检定规程中限定 HP[ C泵流量设定值误差为±2％ 。用同一台液相 仪，分别在0．98，1．0，1．02 mL·rain 测定石杉碱 甲对照品和替代对照品西咪替丁的标准曲线的斜率 K，计算校正因子厂，结果显示，流速变化0．02 mL· rain 对石杉碱甲对照品的校正因子厂影响不大， RSD为0．9％ 。

 进一步考察，在0．8，1．2 mL·rain 测定石杉 碱甲对照品和替代对照品西咪替丁的标准曲线的斜 率 ，计算校正因子．厂，结果显示，流速变化0．2 mL·min 对石杉碱甲对照品的校正因子厂影响不 大，RSD为1．4％ 。

 2．4．4 色谱柱柱温X’j’f值测定的影响HPLC的柱 温箱可能存在偏差，药品检验仪器检定规程中限定 环境温度为10～30 oC，8 h内温度波动±3℃ ，HPLC柱温箱示值误差为±0．I℃ 。用同一台液相， 分别在34．9，35．0，35．1℃测定石杉碱甲对照品和 替代对照品西咪替丁的标准曲线的斜率K，计算校 正因子 ，结果显示，柱温变化±0．1℃对石杉碱甲 对照品的校正因子．厂影响不大，RSD为1．1％ 。

 进一步考察32℃ ，38℃ ，测定石杉碱甲对照品 和替代对照品西咪替丁标准曲线的斜率K，计算校 正因子 ，结果显示，柱温进一步变化±3℃对石杉 碱甲对照品的校正因子．厂影响不大，RSD为0．1％ 。

 2．4．5 流动相pH值对 值测定的影响HPLC的 流动相的pH值可能存在偏差，药品检验仪器检定 规程中限定pH值准确度误差为±0．1。用同一台 液相，分别用不同pH值的磷酸盐缓冲液(取磷酸二 氢钾2．72 g，加水1 000 mL溶解，用磷酸调节pH 2．4，2．5，2．6)配制的流动相测定石杉碱甲对照品和 替代对照品西咪替丁的标准曲线的斜率K，计算校 正因子，结果显示，流动相pH值变化±0．1单位对 石杉碱甲对照品的校正因子．厂影响不大，RSD为 0．9％ 。

 2．4．6 流动相的组成比例对．厂值测定的影响 HPLC的流动相的比例可能存在偏差，量筒示值误 差为1．0％。用同一台液相，分别在流动相以乙腈一 磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钾2．72 g，加水1 000 mL 溶解，用磷酸调节pH 2．5)在(5：95)，(10：90)和 (15：85)比例下测定石杉碱甲对照品和替代对照品 西咪替丁标准曲线的斜率K，计算校正因子，结果显 示，流动相比例变化对石杉碱甲对照品的校正因子 影响不大，RSD为1．3％ 。

 2．4．7 不同液相色谱仪对 值测定的影响 用依 利特ODS2(4．6 mm x 150 mm，5 m)柱，柱号： E1418085(色谱柱2)在3台高效液相色谱仪：岛津 LC2010A高效液相色谱仪；Watem2690-2487高效 液相色谱仪；Agilentl 100高效液相色谱仪进行测 定。结果显示，高效液相色谱仪的变化，对石杉碱甲对照品的校正因子 影响不大，RSD为1．9％ 。

 2．4．8 f值测定由“2．4”各影响因素不同的RSD (％)可以看出，在测定校正因子．厂值时，不同色谱柱 和不同仪器是影响方法耐用性的主要因素。所以 值取“2．4．1”和“2．4．7”两值的平均值 厂=(2．364 3 +2．360 4)／2=2．362 4。

 2．5 线性关系考察

 采用“2．3”项下系列浓度的对照品石杉碱甲和 替代对照品西咪替丁的标准工作溶液，按 值测定 方法测定石杉碱甲和西咪替丁的线性回归方程。结果表明，石杉碱甲在2．5—160 mg·L 内线性关系 良好，回归方程(n=7)为A=4 155．440 4p+ 0．961 7，r=1．000 0；西咪替丁在0．1—20．0 mg· L 内线性关系良好，回归方程(n=7)为4= 10 030．953 6p +0．439 2，r=1．000 0。

 2．6 精密度和重复性实验

 2．6．1 精密度实验取含对照品石杉碱甲0．01 g·L 和替代对照品西咪替丁0．005 g·L 的标准 工作溶液，重复进样6次，记录石杉碱甲和西咪替丁 的峰面积，测定结果表明，RSD分别为0．9％ 和 0．4％ 。

 2．6．2 重复性实验取同一批(批号50102)石杉 碱甲片，采用替代对照品西咪替丁，按“2．10．1”项 下操作，平行测定6份，计算标示含量为96．5％ ， RSD =1．1％ 。

 2．7 回收率实验

 精密称取石杉碱甲对照品适量，加0．01 mol· L 盐酸溶液溶解并定量稀释制成每1 mL中约含 0．008(80％)，0．01(100％)，0．012(120％)mg的溶 液各3份；精密称取石杉碱甲对照品适量，加0．01 tool·L 盐酸溶液溶解并定量稀释制成每1 mL中 约含0．01 mg的溶液2份；精密称取替代对照品西 咪替丁适量，加流动相溶液溶解并定量稀释制成每 1 mL中约0．005 mg的溶液2份。

 采用对照品进行含量测定，按外标法直接测定 A 样品浓度C = ，用测得C 浓度计算回收率见 n r／ r 表1。

 采用替代对照品进行含量测定，被测样品浓度 A C2=fx ，用 浓度计算回收率见表2。

 另用4台高效液相色谱仪，每台仪器配一根不 同的色谱柱按“2．7”测定回收率，汇总对照品和替 代对照品测定的平均回收率见表3。

 2．8 样品溶液稳定性考察

 取供试品溶液(批号50102)和替代对照品溶液 各1份，分别在0，2，4，6，8 h进行测定，记录峰面 积。结果表明，石杉碱甲供试品溶液和替代对照品 溶液在8 h内稳定性均良好，RSD分别为0．7％ ， 0．5％ 。

 2．9 检测限和定量限测定

 石杉碱甲的检测限(S／N=3)取l mg·L～，定 量限(S／N=10)是2．5 mg·L～。

 2．10 样品含量测定

 2．10．1 用替代对照品测定样品含量精密量取供 试品溶液20 ，注入液相色谱仪，在310 nm检测 记录色谱图；另取替代对照品西咪替丁适量，精密称 定，加流动相溶液溶解并定量稀释成质量浓度约 0．005 g·L 的溶液，作为对照品溶液，精密量取对 照品溶液20 L，注入液相色谱仪，在220 nm检测 记录色谱图。按外标法进行计算，所得结果乘以校 正因子2．362 4得石杉碱甲含量。

 2．10．2 用对照品测定样品含量在用替代对照品 测定样品含量的同时，称取石杉碱甲对照品适量，用 0．01 tool·L 盐酸溶液溶解稀释成质量浓度约 0．01 g·L 的溶液，作为对照品溶液，精密量取20 L，注入液相色谱仪，在310 nm检测记录色谱图。 按外标法进行计算，得石杉碱甲含量。替代对照品、 对照品及样品色谱图见图2

 测定3批石杉碱甲片(31001，41001，50102)的 标示量，每批分别用对照品和替代对照品测定5次， 求得平均值，进行成组资料t检验，结果显示，P值大于0．05，即用对照品和替代对照品两种方法测定 的结果无显著性差异。见表4。

 3 讨论

 流动相的比例我们定为乙腈一磷酸盐缓冲液 10：90，在上述6根色谱柱中，用150 mm长的色谱 柱，石杉碱甲的保留时间约6．5 rain，西咪替丁保留 时间约3．5 rain，用250 lllm长的色谱柱，石杉碱甲 和西咪替丁保留时间都略有延长，但在14 rain内都 能完成分析任务。另外我们考察了乙腈一磷酸盐缓 冲液15：85和5：95比例，在实际工作中可以根据实 际情况对流动相的比例进行适当调整，得到适当的 测定时间，以满足要求。

 在进行／值测定的耐用性考察中，我们根据仪 器证书或有关规定确定了测试条件变化的范围并适 当扩大了考察条件，以便有更好的耐用性。

 替代对照品测定石杉碱甲含量引入了校正因子 ／，虽然比采用对照品测定石杉碱甲含量引入新的误 差，但根据实验情况，我们认为用替代对照品进行石 杉碱甲片药品质量控制是可行的、实用的。