大蒜主要具有抗感染、防治心血管疾病和抗肿瘤等功效⋯ 。目前公认大蒜的功效成分是蒜酶(Alli． inase，EC 4．4．1．4)催化裂解|s一烯丙基． 一半胱氨酸亚砜(S—allyl—L．cysteine sulfoxide)，即蒜氨酸(Alliin)， 而产生的大蒜辣素(Allicin)、阿霍烯(Ajoene)等系列含硫有机化合物，蒜氨酸与蒜酶反应生成大蒜辣素 降解过程参见文献[2]。由于大蒜功效成分的分离、提取或人工合成十分困难，而且化学性质极不稳 定，易分解，无法长期保存 。目前国内外的研究思路是从鲜蒜中分别提取化学性质相对稳定的蒜氨 酸及蒜酶，制成蒜氨酸／蒜酶复合制剂，让其在体内释放大蒜辣素，充分发挥疗效。

 测定大蒜辣素含量测定方法报道很多，有定硫法 j、电化学方法 J、生物检定方法_6 J，薄层扫描 法 、紫外法 l9 及高效液相色谱法(HPLC)[10-12]等，其中定硫法、电化学方法测定的是含硫总量，生物 检定方法是利用大蒜辣素的抗菌活性进行测定，专属性差；薄层扫描法为半定量方法，紫外法需要进行 衍生化(利用吸收系数法)，且衍生化的专属性不强，测定是一类化合物的总和；高效液相色谱法 (HPLC)等测定大多需要采用大蒜辣素对照品进行对照，由于大蒜辣素稳定性差，其对照品的制备、标 化和储存都很困难，限制了该方法的应用。

 欧洲药典5．0收载的Garlic powder中 ，将大蒜辣素列为大蒜粉质量控制指标，采用羟苯丁酯作 为大蒜辣素的替代对照品，分别测定大蒜辣素与羟苯丁酯的峰面积，按1 mg羟苯丁酯相当于8．65 mg 的大蒜辣素的关系计算大蒜辣素的量，对该方法考察时发现，该方法存在以下不足：(1)分析时间长，大 蒜辣素与羟苯丁酯之间的色谱保留相差太大(大蒜辣素在5 min左右出峰时，羟苯丁酯的出峰时间约为 23 min)；(2)羟苯丁酯与大蒜辣素之间校正因子偏大(． 大=8．65)，使得供试品溶液尤其是高效制剂 需要多步稀释，给实验操作也带来不便。本研究在EP5．0方法的基础上，建立了分析时间更合适、适用 范围更广的替代对照品HPLC法，供测定蒜氨酸／蒜酶复合制剂的大蒜辣素含量。

 2 实验部分

 2．1 仪器与试样

 8A制备型全自动高效液相色谱仪(配置LC．8A制备型蠕动泵，SPD—M10AvpDAD检测器，SCL一10Avp系统控制器，SIL一10A自动进样器和FRC一10A组分收集器，岛津公司)，uV一2550型紫外分光光度 计，2996高效液相色谱仪(Waters公司)，TSQ型LC—MS／MS联用仪(Finnigan公司)，AV一500 MHz H核 磁共振光谱分析仪(Bruker公司)。

 蒜氨酸粗品、蒜酶均由新疆医科大学提供，5，5 一二硫代双(2一硝基苯甲酸)(DTNB)为比利时进口 分装(97．0％)，￡一盐酸半胱氨酸、羟苯甲、乙、丙、丁酯均由江苏药品检验所提供(纯度99．9％)，Hepes 盐为Sigma公司进口分装，甲醇为色谱纯，水为去离子水，其余试剂均为分析纯。

 2．2 实验方法

 2．2．1 高纯度大蒜辣素溶液的制备 以十八烷基键合硅胶为填充剂(C 柱，250 mm X18 mm，5 m)， 甲醇一水(70：30)为流动相，10 mL／min的流速，242 nm检测波长，分别称取蒜氨酸、蒜酶适量，分别用水 溶解并制成10 g／L、5 g／L的溶液，两溶液等体积混匀，在37℃温孵5 min后，过滤，取400 IxL测定，用 全自动组分收集器收集主峰，合并收集液，即得。

 2．2．2 收集液中主成分大蒜辣素的结构鉴定(1)色谱条件c 色谱柱(250 mm X4．6 mm，5 m)； 流动相为 (甲醇)：V(0．4％ 甲酸)：70：30，流速为1．0 mL／min；分流比为7：3，MS检测；柱温：35℃ ；进 样量为20 。(2)质谱检测参数电喷雾正离子化(ESI )，喷雾电压5000 V，雾化气压0．243 MPa，辅 助气压力0．02 MPa；毛细管温度350℃。全离子扫描(TIC)和二级质谱扫描(product)检测(Ar气CID， 0．2 Pa，能量10 eV)。取上述收集液20 ，注入色谱仪，进行全离子扫描(m／z 50～180)和二级质谱扫 描，记录主峰的一级、二级质谱。(3)核磁共振光谱(NMR)条件 取上述收集液适量，室温下旋转蒸发 除去甲醇，无水乙醚萃取，氮气低温吹干，以CDC1 为溶剂，测定其 H NMR、¨C NMR。

 2．3 收集液中大蒜辣素含量测定

 2．3．1 吸收系数法量取大蒜辣素对照品溶液2 mL，置于50 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，制成供 试品溶液，在240 nm的波长下测定吸光度，用吸收系数145．4 计算大蒜辣素含量。

 2．3．2 衍生化分光光度法 (1)原理根据文献报道 I9 J，1 mol半胱氨酸可以和1 mol 5，5 一二硫代双 (2一硝基苯甲酸)(DTNB)反应生成1 mol 2一硝基一5一硫代苯甲酸(NTB)。

 NTB在412 nm处具有最大吸收，该波长下其它组分无干扰，摩尔吸光系数为14150(1 cm的光 程)；大蒜辣素(allicin)也可与半胱氨酸的巯基反应，1 mol大蒜辣素可以很快地与2 mol半胱氨酸完全 反应。

 根据上述原理，先用过量的5，5 一二硫代双(2一硝基苯甲酸)与定量的半胱氨酸反应，在412 nm处测 得吸光度A。；再将过量的半胱氨酸先与大蒜辣素反应后，剩余的半胱氨酸与过量的5，5 一二硫代双(2一硝 基苯甲酸)反应，在412 nm处测得吸光度A，根据式(1)推算反应前后半胱氨酸浓度的变化，大蒜辣素 的浓度即为半胱氨酸在DTNB／NTB体系中浓度减低的一半，大蒜辣素的含量：

 式中／3为半胱氨酸溶液的稀释倍数， 为大蒜辣素制备液相收集液的稀释倍数，A。为L一半胱氨酸溶液 直接与衍生化试剂反应的溶液吸光度，4为￡一半胱氨酸溶液与大蒜辣素反应后在与衍生化试剂反应的 溶液吸光度，14150为NTB的吸光系数，162．32为大蒜辣素的分子量。(2)测定方法取￡一胱氨酸适量，精密称定，用50 mmol／L Hepes缓冲液(用1 mol／L NaOH调节pH至7．5)溶解，配制成10 mmol／L 半胱氨酸溶液，取5 mL于试管中，加去离子水1 mL，摇匀后，取1 mL于100 mL容量瓶中，加水至刻度， 得 一半胱氨酸溶液稀释液。称取适量DTNB，用50 mmol／L Hepes缓冲液溶解，配制成1．5 mmol／L DTNB溶液。量取大蒜辣素对照品溶液2 mL，置50 mL容量瓶中，用50 mmol／L Itepes缓冲液稀释至刻 度，得大蒜辣素溶液。量取DTNB溶液1 mL，置10 mL容量瓶中，用 一半胱氨酸溶液稀释至刻度后， 26℃水浴15 min，在412 nm波长下测定其初始吸光度值( 。)。另取10 mmol／L半胱氨酸溶液5 mL， 加入1 mL大蒜辣素溶液，在26℃保温15 min后，取1 mL反应混合液于100 mL容量瓶中，加水至刻 度，得反应混合液的稀释液。准确量取DTNB溶液1 mL，置10 mL容量瓶中，用反应混合液的稀释液稀 释至刻度后，置26 cc水浴15 min，在412 nm波长下测定其初始吸光度值( ) 按原理中的公式计算大 蒜辣素的含量。

 2．3．3 I-IPLC法 以用十八烷基键合硅胶为填充剂的Alhech C】8柱(250 mm×4．6 mm，5 m)，甲 醇一1％ 甲酸(65：35)为流动相，流速为1．0 mL／min，检测波长为254 nm，称取羟苯丁酯约20 mg，置 100 mL量瓶中，用60％ 的甲醇溶液溶解并稀释至刻度，精密量该溶液1 mL、收集液2 mL，置20 mL容量 瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，取20 L，注入色谱仪，按式(2)计算大蒜辣素的含量c。 C =8．65S1flm／S2Ol (2) 式中， 为大蒜辣素的峰面积， 为羟苯丁酯的峰面积，m为羟苯丁酯的称重(g)，Ol为羟苯丁酯稀释 的体积， 为大蒜辣素对照品溶液稀释的倍数，1 mg羟苯丁酯相当于8．65 mg大蒜辣素。

 3 结果与讨论

 3．1 收集液中主成分的结构鉴定

 HPLC—MS／MS法测得制备液相收集液中主峰的准分子离子([M+H] )的m 为163，与大蒜辣素 的分子量相应(MW 162)，与大蒜辣素分子结构中无氮原子也吻合；主峰的二级质谱特征碎片有(按丰 度由大到小)：m／z 73、41、87、45、89、59、39、105、121和145，按大蒜辣素分子结构均能得到合理的归属， 制备液相收集液乙醚提取物的 H NMR(图1a)、 3C NMR(图1b)显示，该物质共有6种不同环境的10个 质子共振峰，各峰积分比(由低场向高场)为：2：2：1：1：3，其中， >5有6个(为烯质子)，与大蒜辣素的 分子结构中氢原子组成相符，"C NMR谱中，除去溶剂峰，共有6种不同环境的6个碳的共振峰： 132．81， 125．74， 118．93， 118．93， 59．77， 34．91，其中， >100有4个(为碳烯)，总碳数及碳种 类与大蒜辣素分子结构相符，结果表明，收集液的主成分为大蒜辣素。

 3．2 收集液中大蒜辣素的纯度和溶液稳定性

 在2．3．3节色谱条件下，取室温放置不同时间的收集液进行纯度分析，用归一化法计算，结果表明， 该溶液至少在24 h内稳定，纯度均大于99％ 。

 3．3 收集液中大蒜辣素的测定

 按2．3节的方法分别测定上述收集液中大蒜辣素的含量，吸收系数法、衍生化法和HPL法分析结果分别为0．6057、0．7196和0．7184 g／L。取后两种方法测定结果的平均值0．719 g／L作为该大蒜辣素溶 液的含量，用该溶液作为大蒜辣素的对照溶液，用于替代对照品测定大蒜辣素含量。

 3．4 HPLC方法测定大蒜辣素含量的

 3．4．1 替代对照品的选择本实验又分别考察了二烯丙基氨、羟苯甲、乙、丙、丁酯与大蒜辣素的色谱 保留时间及分离情况，结果显示，该条件下二烯丙基氨色谱峰严重变形，羟苯甲酯与大蒜辣素无法分离， 羟苯丙、丁酯与大蒜辣素色谱保留仍相差较大，只有羟苯乙酯与大蒜辣素的分离比较合适(图2)，且羟 苯乙酯与大蒜辣素均能与各自相邻杂质良好分离，所以，选用羟苯乙酯作为大蒜辣素含量测定用的替代 对照品，其比EP5．0中的羟苯丁酯更合适。

 3．4．2 检测波长的选择EP5．0方法的检测波长为254 nm，1 mg羟苯丁酯相当于8．65 mg大蒜辣素。 前期研究结果显示，羟苯乙酯与羟苯丁酯的之间的校正因子约为1．16，预见大蒜辣素与羟苯乙酯的校 正因子会更大。本实验选用大蒜辣素的肩峰波长242 nm作为检测波长，该波长下，羟苯乙、丙、丁酯的 吸收远小于254 nm处的吸收(图3)，减小了羟苯乙酯对大蒜辣素的校正因子，提高检测的准确度。

 3．4．3 大蒜辣素、羟苯乙酯标准曲线的绘制量取大蒜辣素对照溶液2 mL，分别置于20和5 mL的量 瓶中，用流动相稀释至刻度，作为对照溶液A和对照溶液B，分别精密量取对照溶液A 5、10、20 、对 照溶液B 10、20、30、40、50 及大蒜辣素对照品溶液40、80 ，注入液相色谱仪，记录主峰面积，按进 样量20 L折合供试品的浓度，在0．018～2．9 g／L的浓度范围内，用大蒜辣素的浓度(X)对色谱峰的峰 面积(y)进行线性回归，得线性方程，Y=10405000X +58622(r=0．9999)。

 准确称取羟苯乙酯0．01813 g，置于100 mL量瓶中用流动相稀释至刻度，精密量取1 mL，分别置于 20和5 mL的量瓶中，用流动相稀释至刻度，作为对照溶液C和对照溶液D，分别精密量取对照溶液C 5、10、20 、对照溶液D 10、20、30、40和50 及原液40 ，注入液相色谱仪，记录主峰面积，按进样 量20 L折合供试品的浓度，在2．3～360 mg／L的浓度范围内，用羟苯乙酯的浓度(X)对色谱峰的峰面 积(y)进行线性回归，得线性方程，Y=1．019×10 X(r=0．9991)。表明大蒜辣素在18～2870 mg／L的浓 度范围内、羟苯乙酯在2．3～360 mg／L的浓度范围内，可用任一浓度溶液进行二者校正因子的测定。

 3．4．4 羟苯乙酯与大蒜辣素之间校正因子的测定称取羟苯乙酯约20 mg，置于100 mL容量瓶中，用 流动相溶解并稀释至刻度，精密量取该溶液1 mL，大蒜辣素对照品溶液2 mL(0．719 g／L)，置于20 mL 的量瓶中，用流动相稀释至刻度，作为供试品溶液，精密量取20 ，注入液相色谱仪，记录大蒜辣素、羟 苯乙酯主峰面积，以主峰峰面积除以供试品浓度计算各自的响应因子，再以羟苯乙酯的响应因子比大蒜 辣素的响应因计算大蒜辣素对羟苯乙酯校正因子，结果见表1。结果表明，该条件下，1 mg羟苯乙酯相 当于4．71 mg大蒜辣素。在上述规定的色谱条件下，可以按上述对应关系，采用羟苯乙酯代替大蒜辣素 测定溶液中大蒜辣素含量。

 3．4．5 蒜酶活力的测定用上述建立的方法测定3批蒜酶活力测定用溶液中大蒜辣素含量，进一步利用一分子大蒜辣素需要消耗2分子蒜氨酸的关系推算蒜酶活力，测定结果与传统的通过测定蒜氨酸减 少量进行换算的方法m 结果一致(见表2)，表明本方法准确可靠。

 3．5 方法的准确性

 文献[3]报道，大蒜辣素稳定性很差，室温 下，纯大蒜辣素半衰期为2～16 h，在大蒜汁或 破碎大蒜中，其半衰期为2．4 d，在1：1大蒜汁 和水的稀释液中，其半衰期为22 d，冷冻干燥 可以使大蒜辣素的寿命延长至40 d，目前国内 外尚无法提供大蒜辣素对照品。本研究根据大蒜辣素在水溶液中相对稳定的特点，采用制备型高效液相制备大蒜辣素溶液，并对该溶液的含量进行 标定，以此作为对照品溶液，供寻找大蒜辣素含量测定用替代对照品。测定制备液相收集的大蒜辣素溶 液含量时发现，采用文献提供的吸收系数法与衍生化紫外分光光度法和EP5．0法的测定结果差异较 大，但后两种方法之问的测定结果吻合，可能是由于第一种方法中大蒜辣素的吸收系数测定有误差引 起；研读文献发现，衍生化紫外分光光度问接测定法是经过系统验证的，该方法与HPLC外标法的测定 结果进行过比较，两种方法测定结果一致，故该测定方法有较大的可信度，尽管其专属性较差，但本实验 中供测定的溶液纯度高，可以弥补该方法的不足。与EP5．0方法比较，本研究建立的方法大大缩短了 分析时间，步骤明显简化，提高了测定的准确度，解决了无大蒜辣素对照品导致其含量无法测定的困难。