1 仪器与试剂

 x一4型显微熔点仪(国产，温度计未校正)；INOVA一400型 核磁共振仪(TMS为内标)；HP 5973质谱仪(电离条件为7O eV)；KQ一250B型超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；高 效薄层层析板(GF254，青岛海洋化工厂生产)；甲醇、乙腈为色谱 醇，其他化学试剂均为分析醇，水为纯净水。

 延胡索药材采自浙江省东阳市，经贵阳中医学院陈德媛教授 鉴定为罂粟科植物延胡索Corydalis yanhusuo W．T．Wang．的干 燥块茎。

 2 方法与结果

 2．1 去氢紫董碱粗提物的制备取延胡索粗粉5 ，用10倍量 的70％ 的乙醇回流提取两次，2 1／次，滤过，滤液减压回收溶剂， 得乙醇提取浸膏。乙醇提取浸膏加入10％ 的盐酸溶液溶解，调 pH 2～3，滤过。滤液用石油醚萃取，水部分用浓氨水调pH 9～ 10，用氯仿萃取，氯仿部分再用水洗，浓缩水洗液至浸膏。将上述 所得浸膏上硅胶柱，用氯仿一甲醇一醋酸乙酯梯度洗脱，收集氯 仿一甲醇一醋酸乙酯(8：1：1)部分，低温减压回收溶剂得去氢 紫堇碱粗提物。

 2．2 色谱条件

 2．2．1 制备HPLC色谱条件XTerra Prep RP一18柱(10 m ， 150 mm ×7．8 mm)；柱温为室温；检测波长345 am；流动相为 0．O1 mo]·L 碳酸氢铵溶液(用浓氨水调pH 10．5)一乙腈(83 ：17)，流速：2．0 ml／min。

 2．2．2 分析HPLC色谱条件Diamonsi] C18柱(5 m，250 mm ×4．6 mm)，柱温3OoC；检测波长345 nm；流动相为0．03 mo]／L 的磷酸二氢钾缓冲液一乙腈(74：26)，流速1．0 ml／min。

 2．2．3 去氢紫堇碱对照品的制备纯化取去氢紫堇碱粗提物 1．0 g，用10 ml甲醇超声溶解，过0．45 m滤膜，备用。吸取1．0 ml样品进半制备型高效液相色谱仪，收集保留时间所在的组分， 减压回收溶剂，得去氢紫堇碱粉末。加乙醇适量溶解，重结晶， 即得。

 2．3 样品纯度检测及结构鉴定

 2．3．1 晶形确定取少许冷冻干燥絮状物于表面皿中，加少量 无水乙醇溶解，常温下放置3 d，黄色柱状结晶析出。

 2．3．2 薄层色谱检测薄层板：高效薄层层析板(GF： )。3种 展开剂系统：以氯仿一甲醇(5：t)；氯仿一甲醇一醋酸乙酯(8： 1：1)；乙醚一环己烷一甲醇(5：3：1)。点样：在同一板上，按 5，10，15，20，25 Ix]不同的浓度点样。展距8 cm，定位后经紫外 254 nlTl，碘蒸气及碘化铋钾溶液显色检视。结果在薄层色谱同一 位置处，均为单一斑点，未见杂质斑点，符合化学品要求。

 2．3．3 紫外检测取去紫堇碱对照品乙醇溶液经紫外光谱扫 描，结果表明最大吸收波长为345 nm。因此，确定345 nm为测定 波长。

 2．3．4 面积归一化法精密称取去氢紫堇碱对照品，用流动相 制成浓度为0．13 mg·ml 的样品溶液，照“分析HPLC色谱条 件”，进样10 l，样品显示为单峰，用面积归一化法计算含量为 98．7％(保留时间为rain)，符合中药化学对照品含量测定用要求，结果见图1。

 2．3．5 结构鉴定去氢紫堇碱为黄色晶状柱晶(乙醇)，熔点 135％ 。EI—Ms m／z：366[M] ． H NMR(400 MHz，CDCI3)6： 1．97(3H，S，CH3—13)，3．24(2H，t，J=5．2 Hz，5一H)， 3．94(3H，S，0CH )，3．99(3H，S，OCH )，4．05 (3H，S， OCH )，4．02(3H，S．0CH )，5．03(2H，t，J： 5．2 Hz，6一 H)，6．93(1H，S，4一H)，7．19(1H，S，1一H)，7．87(1H，d， J=9．6 Hz，12一H)，7．99 (1H，d，J = 9．6 Hz，l1一H)， 10．11(1H，S，8一H)． ”C NMtt(100 MHz，CDC13)8：18．0 (CH3一l3)，28．1(C一5)，56．3，56．6，57．0(3OCH3)，57．5(C 一6)，62．6(OCH3)，l10．8(C一4)，113．3(C一1)，119．2(C— l3)，120．3(C一11)，121．6(c一12a)，125．7(C一12)，129．4(c 一8a)，131．9 (C一4a)，133．8(C一13b)，136．5 (C一13a)， 145．1(C一8)，145．7(c一10)，147．9(C一2)，150．4(C一3)， 151．4(c一9)。以上波谱数据与文献报道 的一致，故鉴定为 去氢紫堇碱。

 2．4 延胡索药材中去氢紫堇碱的含量测定

 2．4．1 色谱条件与系统适应性实验照“分析HPLC色谱条件” 项，样品的理论塔板数均大于8000，分离度均大于2．7(见图2)， 说明该方法用于延胡索中样品去氢紫堇碱的含量测定可行。

 2．4．2 供试品的制备称取延胡索粗粉约1 g，精密称定，置20 ml具塞三角瓶中，加入1％ 的盐酸甲醇2O．o0 m1，称重，40℃超 声提取30 rain，取出，补足减失重量，冷却，滤过，取续滤液1O．00 ml，回收乙醇，流动相定容至10．00 ml，过0．45 m滤膜，备用。

 2．4．3 线性范围考察精密称取去氢紫堇碱对照品0．0153 g于 20 ml容量瓶中，用流动相定容，得去氢紫堇碱储备液。再从中取 1．00 ml置于l0 ml容量瓶中，用流动相定容，得浓度为76．5 g ·m1 的对照品标准溶液。分别精密吸取对照品标准溶液1，2， 3，4，5，6 Ixl注人色谱仪，记录峰面积。以色谱峰积分面积为纵坐 标(y)，去氢紫堇碱的进样量为横坐标( )，绘制标准曲线，得 回归方程：Y=5 457．104 2X一17．122 1，r=0．999 8，样品在0．076 3～0．457 6 Ixg浓度范围内线性关系良好。

 2．4．4 精密度实验精密吸取同一对照品液3 Ix]，照前述色谱 条件重复进样6次，测得去氢紫堇碱峰面积积分值的RSD为 0．67％ ，表明测定仪器精密度良好。

 2．4．5 重复性实验取同一批样品，按“供试品溶液的制备”方 法，平行制备供试品溶液6份，按前述色谱条件进样10 l，测得 去氢紫堇碱总含量平均值为0．9713 mg·g～，RSD为2．48％ ，表 明测定方法重复性良好。

 2．4．6 稳定性实验将同一份供试品溶液放置0，2，4，8 h后，照 前述色谱条件进样1O l，测得去氢紫堇碱在8 h内峰面积的 RSD为1．79％ ，表明供试品溶液在8 h内稳定性良好。

 2．4．7 回收率实验取已知含量的样品约0．5 g，共6份，精密 称定，分别加入不同量的去氢紫堇碱对照品，按“供试品溶液的 制备”方法制备，按前述色谱条件进样10 l，测得去氢紫堇碱的 平均回收率为104．44％ ，RSD为2．36％(n：6)，表明测定方 法准确可靠。结果见表1。

 3 讨论

 延胡索生物碱类大部分属于小檗碱或原小檗碱型，它们性质 相差较小，极性相近，前人对去氢紫堇碱的分离采用的均是常压 硅胶柱法，效率较低。本研究通过常规方法分离得到去氢紫堇碱 粗品，再用反相高效液相色谱法提纯去氢紫堇碱，方法简便易行产品纯度好，成本低，适合去氢紫堇碱对照品的大量制备。

 目前采用反相高效液相色谱测定延胡索中去氢紫堇碱含量 文献报道很少，大部分是关于延胡索乙素含量的测定，这难以全 面反映延胡索药材的内在质量。测定去氢紫堇碱在延胡索中的 含量，对于控制延胡索产品的质量具有重要的意义。