油茶皂苷中主要含有油茶皂苷A和山茶皂苷 C，目前市场上没有油茶皂苷的对照品出售，因此给 油茶皂苷的质量评价带来一定的困难。现行的制备 油茶皂苷对照品的方法大多都采用薄层层析法 J， 该法操作繁琐，得到样品量少，影响产品的定性定 量。本文采用大孔树脂纯化结合重结晶法制备油茶 皂苷对照品，其分离工艺简单，便于操作，可以获得 大量高纯度的油茶皂苷对照品，能够满足常规检测 分析的要求。

 油茶皂苷的定量方法一直以来都没有统一的参 考标准，现有方法主要有重量法、比色法 j、荧光光 度法和速差分光光度法 、薄层扫描法 ¨，反相液 相色谱法¨ 也有报道，但是不同方法测定的数据差 异较大，所以油茶皂苷的定量分析方法值得进一步 深人研究。本文利用自制的油茶皂苷对照品，摸索 探究采用HPLC法对油茶皂苷进行定量，并根据不 同质量浓度的油茶皂苷的峰面积绘制标准曲线。同 时，比较香草醛浓硫酸显色法和HPLC法定量油茶 皂苷。

 1 材料与方法

 1．1 实验材料、仪器

 供试粗油茶皂苷，购于上海地源食品有限公司， 初步测定其纯度为34％ ；AB一8大孔树脂，安徽三 星树脂科技有限公司；薄层层析硅胶板，安徽一力生 化试剂有限公司；无水乙醇、甲醇、丙酮、浓硫酸、香 草醛等为分析纯；甲醇、乙腈均为色谱纯；超纯水。

 层析柱，离心机，超声波清洗器，水浴锅，旋转蒸 发仪，紫外扫描仪，uV一2102C紫外可见分光光度 计。色谱柱(Angilen，TC—C 25 m，250 mm×4．6 mm)：安捷伦公司。Waters600 Controller／2478 Dual Absorbance Detector：美国Waters公司。

 1．2 实验方法

 1。2．1 油茶皂苷对照品的制备

 1．2．1．1 AB一8大孔树脂纯化

 1．2．1．1．1 装柱称取AB一8大孔树脂200 g，湿 法装柱，纯水清洗，洗至流出液无醇味，为透明的液 体。

 1．2．1．1．2 上样配制粗油茶皂苷质量分数为5％ 的水溶液共计400 mL，上样流速为0．2 mL／min，上样 至树脂吸附饱和并有少量黄色浑浊的油茶皂苷流出。 由于油茶皂苷在冷水中的溶解性较差，上样液温水溶 解并不时地加热保持其温度。同时加热还有利于提高AB一8大孔树脂对油茶皂苷的吸附能力。

 1．2．1．1．3 洗脱洗脱步骤为：①水洗，将不能被 树脂吸附的杂质和溶于水的杂质洗脱下来，洗至流 出液为透明无色为止；② 0．05％NaOH洗脱，能使黄 酮单宁类以离子形式存在，从而使吸附力减弱被洗 脱下来¨ ，洗脱过程中黄色晕圈不断流出；③水洗， 将NaOH和溶解在碱性环境中的其他物质洗掉，洗 至pH为7；④20％ 乙醇洗脱，油茶皂苷中存在的杂 质很复杂，20％ 乙醇洗脱目的是为了洗去溶于乙醇 中的杂质，洗至流出液无色为止；⑤50％ 乙醇洗脱， 随着乙醇体积分数的增大，油茶皂苷也被洗脱下来， 50％ 乙醇几乎能将油茶皂苷全部洗出，洗至流出液 无色；⑥75％乙醇洗脱，彻底洗掉吸附在树脂上的油 茶皂苷，洗至流出液无色。

 1．2．1．1．4 检测采用香草醛浓硫酸比色法测定 不同洗脱流出液的吸光度。吸取不同洗脱液洗脱的 流出液100 L，水浴蒸干后，分别加入0．5 mL甲醇 溶解，随后加入0．5 mL 0。8％ 的香草醛乙醇溶液和 77％ 的浓硫酸溶液，空白加入随行试剂。摇匀后于 60℃ 水浴加热15 min，冰水浴10 min后548 nm处 测定各溶液的吸光度，比较各洗脱流出液中皂苷含 量的高低。

 1．2．1．2 甲醇重结晶 选择50％ 乙醇洗脱的流出 液蒸干，然后加入热甲醇充分溶解，冷却后再使用丙 酮沉淀，静置过夜后离心得到沉淀，再加入热甲醇溶 解，丙酮沉淀，离心，如此反复。最后将得到的沉淀 收集，加入热甲醇溶解，冷却后冰箱中放置2 d，然后 过滤得到结晶，挥发甲醇后于6O℃真空干燥箱中干 燥，得到油茶皂苷对照品。

 1．2．2 对照品的定性纯度检测

 1．2．2．1 薄层层析法将制备的对照品采用薄层 法检测，展开剂选用两种不同的体系进行检测。 展开体系1为： (乙酸乙酯)： (甲醇)： (正丁 醇)：水=3：2：5：10 16]，充分摇匀后取上相作为展 开体系；展开体系2为： (正丁醇)：V(冰醋酸)：V (水)：8：1：3 。

 1．2．2．2 紫外光谱分析称取少量油茶皂苷对照品，溶于一定量的甲醇中(质量浓度为1 mg／mL)， 在紫外可见光扫描仪上扫描，得到紫外光谱图。

 1．2．2．3 乙酸酐浓硫酸反应(Liebermann—Bur． chard) 称取少量对照品溶于0．5 mL乙酸酐中， 按 (乙酸酐)：V(浓硫酸)=20：1的比例滴加浓硫 酸，观察颜色变化。

 1．2．3 油茶皂苷定量测定

 1．2．3．1 香草醛浓硫酸显色法准确称取制备的油茶皂苷对照品15 mg，甲醇溶解，摇匀后置于25 mL的容量瓶中定容备用，质量浓度为0．6 me／mE。 分别吸取上述所配制的油茶皂苷对照液0．1、0．2、 0．3、0．4、0．5 mL，置于带塞的试管中，并分别加甲醇 至0．5 mL，再准确加入8％ 香草醛乙醇溶液0．5 mL，然后加入77％ 的浓硫酸溶液4 mL，以0．5 mL 甲醇加0．5 mL的8％香草醛乙醇溶液，再加入4 mL 的77％浓硫酸溶液为空白，摇匀后，于60℃ 加热15 rain，然后置于冰水浴中10 min，取出后室温下于 548 nm处测定吸光度，并根据吸光度与质量浓度关 系绘制出标准曲线。

 1．2．3．2 HPLC法

 1．2．3．2．1 HPLC条件Waters600&2478，进样体 积为5 L。检测波长：209 nm。色谱柱：Angilen，TC — Cl8，25 m，250 mm×4．6 mm。柱温：25 oC。流动 相A：纯水；流动相B：乙腈。运行时间：25 min。梯 度：0～10 rain内流动相B由5％增至25％ ，保持l4 rain后1 rain 内回至5％ 。流速：1 mL／min。

 1．2．3．2．2 HPLC法标准曲线的绘制 准确称取 821 Ixg油茶皂苷对照品，5％ 乙腈溶解定容至5 mL， 分别吸取0．1、0．2、0．3、0．4、0．5 mL再加5％ 乙腈 定容至1 mL，配制不同质量浓度的油茶皂苷对照品，分别为16．4、32．8、49．3、65．7、82．1 g／mL， 0．45 m有机膜过滤后进样，计算不同质量浓度样 品峰面积，根据峰面积与质量浓度关系绘制标准曲 线。

 1．2．4 浓硫酸香草醛显色法与HPLC定量方法的 比较分别称取油茶皂苷样品(购于杭州中野天然 植物有限公司)两份，配制成质量浓度为0．069 2 mg／mL和0．034 8 rag／mE，采用两种定量方法测定 对应的吸光度和峰面积，并根据各自的标准曲线计 算其纯度。

 2 结果与分析

 2．1 油菜皂苷对照品的制备

 2．1．1 AB一8大孔树脂纯化油茶皂苷 表1是 AB一8大孔树脂纯化油茶皂苷时，采用不同洗脱液 的洗脱结果。

 由表1可以看出，不同的洗脱液都能将油茶皂 苷或多或少地洗脱下来，其中以50％ 乙醇洗脱的流 出液中皂苷含量最高，其他洗出液的皂苷含量相对 比较低，所以实验重点收集浓缩50％乙醇洗脱的流 出液。

 2．1．2 甲醇重结晶纯化油茶皂苷将50％乙醇洗 脱液洗脱的流出液收集蒸干后，经过反复的溶解沉 淀，甲醇重结晶后，真空干燥后得到的样品为纯白色 的粉末，共计4 g。

 2．2 油茶皂苷对照品定性纯度检测

 2．2．1 薄层层析检测 对照品在两种展开体系展 开后，5％ 硫酸乙醇显色后于100℃烘箱烘干，结果 显示薄层板均为1个圆点。展开剂为展开体系1 时，圆点Rf值为0．312 5；展开体系2时，圆点 值 为0．137，说明对照品纯度较高。同时对粗油茶皂 苷样品也进行了相同的处理，结果每种展开体系展 开后都有3个圆点显示。

 2．2．2 紫外光谱扫描检测 图1是对照品的紫 外一可见分光光度计的扫描结果。从图1可以看 出，对照品在209 nm有最大吸收，270 nm有一微弱 的吸收峰。由于高纯度的油茶皂苷只在短波长209 nm处有吸收峰，在270 nm处没有吸收峰，因此图1 结果说明所制备的对照品确为油茶皂苷，且其纯度 较高，可以作为定量油茶皂苷的标准品。

 2．2．3 乙酸酐浓硫酸反应 乙酸酐浓硫酸反应现 象为颜色由黄红色迅速变为紫红色。

 另外，将相同量的粗油茶皂苷和对照品分别置于 带塞的试管中充分溶解，相同频率振荡后，对照品的 泡沫高度比粗油茶皂苷高，且泡沫能保持很长时间。

 2．3 两种定量方法的比较

 2．3．1 香草醛浓硫酸显色法标准曲线的绘制 以 自制的油茶皂苷对照品为标准品，548 nm处测定不 同质量浓度的皂苷标样反应液的吸光度，以吸光度 为纵坐标，皂苷质量浓度为横坐标绘制标准曲线 (见图2)，其回归方程为Y=7．64x+0．028 5(R = 0．999 2)。说明皂苷质量浓度与吸光度成正比线性关系，并且线性关系良好。

 2．3．2 HPLC法定量油茶皂苷图3是油茶皂苷对照品的色谱图。由图3可以看出，制备的油茶皂 苷对照品为油茶皂苷混合体中的一种单体，所以纯 度较高，分离度好，可以作为油茶皂苷标准品进行定 量分析。

 图4为油茶皂苷对照品和粗品的色谱图。由图 4可以看出，所制备的对照品为粗油茶皂苷的一种 成分，从色谱图的峰面积可以判断，制备的对照品不 是粗油茶皂苷混合体中含量最高的成分。

 图5是根据不同质量浓度油茶皂苷对照品标准样对应的峰面积而制备的标准曲线。从图5可以看 出，峰面积与进样质量浓度成正比线性关系，并且线 性关系良好(R =0．999 2)，可用于油茶皂苷定量。 2．3．3 同一样品纯度的测定结果比较 表2为同 一油茶皂苷样品采用两种不同的定量方法测定并计 算其纯度的结果，从结果可以看出，采用香草醛浓硫 酸显色法测定的样品纯度值相对于HPLC法测定的 纯度值偏大。原因可能是采用香草醛浓硫酸显色法 测定时，样品中的黄酮、酚类化合物也会与显色剂发 生显色反应，导致测定的吸光度较大。而HPLC法 测定时受样品中杂质的干扰较小，所以其测定的准 确度相对较高。

 3 结论

 (1)本文采用AB一8大孑L树脂对油茶皂苷进行 分离纯化，使用不同的洗脱液将油茶皂苷中的杂质 洗脱，然后结合甲醇丙酮反复溶解沉淀的方法，去除 油茶皂苷中的色素等杂质。经过反复沉淀后再在甲 醇中重结晶，结晶经过真空干燥后为白色固体。再 通过薄层层析、紫外扫描、乙酸酐浓硫酸反应以及 HPLC检测后可以判定为油茶皂苷成分，可以作为 油茶皂苷准确定量的对照品。

 (2)比较了香草醛浓硫酸显色定量法和HPLC 定量法，通过对同一样品的测定结果表明，香草醛浓 硫酸显色法测定的样品纯度值比HPLC法高。这是 因为香草醛显色法反应机理可能是皂苷在强氧化性 酸的作用下脱氢，而根据显色原理可知，由于黄酮类 物质、酚类化合物等与皂苷的结构相似，在采用显 色法时不免对皂苷含量测定准确度有影响。所以 HPLC法可以对油茶皂苷进行较准确的定量。

 (3)由HPLC图谱可以看出所制备的油茶皂苷 为单一的成分，在209 nm处有最大吸收值。而实际 上油茶皂苷是一种多单体组成的混合物，从对油茶 皂苷粗品的HPLC检测也在同一保留时间内有这一 成分出现，可见制备的对照品为油茶皂苷中的某一 单体，其具体的分子结构和化学式还有待于通过进 一步的鉴定才能确定。