药理学研究表明，5F对SPCA一1、K562瘤株有显 著的体外抗肿瘤活性_3]，对荷瘤小鼠肝癌HepA、S18O 在体内也有抗肿瘤活性，有潜力开发成临床用新药_4]。 目前尚无5F对照品，且文献检索未发现5F对照品的 制备研究，这给半边旗药材的开发应用以及含5F的 抗肿瘤新药制剂研究造成极大的不便，作者在此进行从半边旗中制备5F对照品的研究，拟为半边旗的开 发应用提供依据。

 1 实验

 1．1 材料、试剂和仪器

 半边旗植物采收于广东湛江郊区，经广东医学院 苟占平博士鉴定为凤尾蕨属植物半边旗。

 石油醚、丙酮、醋酸、氯仿等均为分析纯，广州华大 试剂公司；甲醇、乙腈，色谱纯，天津四友化工试剂厂。

 GF254薄层层析用硅胶板(20 cm×10 cm)、柱层 析用硅胶(2OO～3OO目)，青岛海洋化工厂；D101型大 孔树脂，天津南开大学化工厂；ShimadzuUV～160OA、 Lc—MS 8OOOa型高效液相色谱～质谱联用仪(包括在 线脱气机，两台LC 1OAVP高压输液泵，SPI)_1OAVP 紫外检测器，柱温箱，APCI源接口，四极杆质谱检测 器)，日本岛津制作所；LC12O0型高效液相色谱(包括 四元泵、DAD检测器、在线脱气机、LC12OO中文工作 站)，美国安捷伦科技有限公司；175C一3UMA500型红 外光谱仪，美国伯乐科技有限公司；Mercury—Plus 3OO 型核磁共振波谱仪，美国瓦里安科技有限公司；AE204 型分析天平，瑞士梅特勒一托利多公司；四用紫外分析 仪，上海顾村仪器厂；MILLI—Q型超纯水制备仪，美国 密理博科技公司。

 1．2 方法

 取半边旗地上部分洗净晾干，粉碎成4O目粗粉， 按照文献[5]方法进行超临界二氧化碳萃取，提取液经 石油醚去除非极性脂溶性成分，加三氯甲烷萃取，萃取 液减压浓缩得到半边旗浸膏。

 称取浸膏200 g，加2O BV无水乙醇溶解，加水至 乙醇含量为70 ，按照1：1体积比加石油醚萃取，萃 余液加水至乙醇含量为3O ，上大孔树脂柱分离，依 次用30％乙醇、45 9／6乙醇、55 乙醇洗脱，收集45 乙 醇的洗脱液，减压蒸干得到类白色粉末，即半边旗5F 粗粉。

 称取5F粗粉2 g，用石油醚：丙酮：冰醋酸(7： 3：0．O5，体积比)混合溶剂3O mL溶解，上硅胶常压 层析柱，用上述混合溶剂作流动相洗脱，每1O mL收 集一份，点样薄板层析，分别用254 nm 紫外灯、20 硫酸一乙醇显色。合并显色呈紫红色斑点的组分，减 压蒸干得到白色粉末，即5F精制品。

 称取5F精制品溶解于适量丙酮中，加水到恰好 出现浑浊，充分混匀后静置于室温下结晶，收集白色针 状晶体，干燥即得5F对照品。

 1．3 检测分析

 1．3．1 TLC分析

 取制备的5F对照品适量，用甲醇溶解配制成1 mg·mL_1的样品溶液，用定量毛细管吸取1．0 L点 样于硅胶板上，分别用石油醚：丙酮：冰醋酸(7：3： 0．05，体积比)、氯仿：甲醇(95：5)、石油醚：乙酸乙 酯(8：2)、二氯甲烷：乙酸乙酯：冰醋酸(6：4： 0．05)四种展开体系展开，取出晾干，硅胶板于254 nm 紫外灯下检视，喷洒20 硫酸一乙醇溶液后放入烘箱 105℃加热10 min，显色。

 1．3．2 HPLC—MS杂质检测

 取制备的5F对照品适量，用甲醇溶解配制成O．2 mg·mL-1的样品溶液，进样5 I ，色质联用仪检测。 色谱条件：色谱柱Lichrospher C18柱(250 mm×4．6 mm，5 m)，流动相5O 甲醇溶液，流速1．O mL· min～ ，柱温为室温。质谱条件：APCI离子源，电极温 度4O0℃ ，电晕电压一4．O kV，离子传输电压+55 V， 温度25O℃ ，偏转电压4O V，检测器电压1．6 kV，喷雾 氮气流速2．5 L·min一，采用总离子流监测(TIC)方 式，扫描进样物质的总离子流，扫描范围( ／z)为50～ 7O0，扫描间隔1 s。

 1．3．3 HPLC归一法纯度测定

 取制备的5F对照品适量，用甲醇溶解配制成 1．O4 mg·mL 的样品溶液，进样2O L，按如下色谱条件检测：色谱柱Hypsel C18柱(250 mm×4．6 mm，5 雎m)，流动相甲醇一1 醋酸溶液(55：45，体积比)，流 速1．O mL·min～ ，柱温35℃ ，检测波长254 nm。按 峰面积归一化法计算该物质纯度。

 2 结果与讨论

 2．1 HPLC-MS检测结果(图2)

 由图2可知，样品经高效液相色谱柱分离，仅产生 一个显著的离子峰，该离子峰经选择性离子监测发现 其离子主要为质荷比331的化合物，可能存在的杂质 物质333和345的含量几乎和噪声信号相当，表明在 纯化过程中几乎完全去除了与对照品结构相似的杂质 成分。

 2．2 纯度测定结果(图3)

 由图3可知，样品经HPLC分离只有一个主要吸 收峰，保留时间为7．62 min，用二极管阵列检测器的 3D图谱显示该峰的纯度，表明该峰是单一成分，纯度 为99．2 。

 2．3 结构鉴定

 2．3．1 理化性质

 本品为白色针状结晶，熔点254～258℃ ，TLC喷 洒20 硫酸一乙醇溶液，在1O5℃加热10 min，显色为 单一紫红色。

 2．3．2 波谱分析(图4)

 ACP卜MS分析发现质荷比[M—H]一为331，表明 该化合物分子量为332。UV mn(CH。OH)：248；IR (KBr)， ， cm_。： 3479、 2939、 2875、 1713、 1646； HNM R (Aceton，30O M Hz)：5．846(H一17， cis)，5．243(H一17，trans)，4．O38(H一11)，3．048(H一 13)，1．454(H一18)，1．O18(H一20)；”CNMR(Aceton， 3O0 M Hz)：15．6(G 2O)，19．2(C-2)，2O．4(C．6)， 28．8(C—l8)，34．5(C_14)，37．1(C一3)，37．5(C_13)， 38．1(C．7)，39．1(C_10)，39．9( 1)，41．0(C一12)， 43．5(C一4)，49．1(C-8)，50．6(C_5)，56．3(C，9)， 65．2(C一11)，110．9(C_17)，l51．3(C一1 6)，l78．8(C_ 19)，2O8．7(C．15)。经与文献[6]对照，该物质被鉴 定为贝壳杉烷型四环二萜化合物5F。

 2．4 讨论

 半边旗植物经二氧化碳超临界萃取，萃取液呈 墨绿色，主要是弱极性的叶绿素和中等极性的萜类 物质被提取出来；经有机溶剂分级萃取后，所得棕黄 色浸膏主要为总二萜酸类成分；再经大孑L树脂分离， 浓缩、干燥得到白色粉末，即为5F粗品，主要成分是 5F，还含有少量其它二萜类杂质；5F粗品经反复硅 胶柱层析分离和重结晶，结构相似的杂质二萜类成 分被进一步除去，5F的纯度不断提高，达到对照品的 要求。

 文献报道[7 在半边旗二萜的分离纯化过程中，有 抗癌活性的化合物5F中通常伴随有非活性成分4F， 两者结构相似，都具有贝壳杉烷型四环二萜基本结构， 分子量分别为332和334，仅相差两个氢原子，这给5F 对照品的纯化制备以及检测带来困难。5F和4F的结 构不同之处在于5F的C一16和G17为双键连接，能够 和C一15的羰基形成a一、 不饱和环戊酮结构，具有共 轭双键，有强烈的紫外吸收，而4F的C一16和C一17为 单键连接，没有共轭双键，无紫外吸收。

 在TLC鉴别实验中，供试品可能含有无紫外吸收的4F，因此仅用紫外灯检视还不能判断供试品是否为 5F单一成分，需用显色反应作进一步的判断。4F和 5F在喷洒2O 9／6硫酸一乙醇为显色剂的硅胶板上加 热，分别显示粉红色和紫红色。本实验中，半边旗浸膏 经展开后紫外检视有多个斑点，表明其中含有多种成 分；5F粗品展开后紫外检视只有一个斑点，但显色剂 显色后产生R，值不同的两个斑点，分别呈粉红色和 紫红色，表明是4F和5F的混合物；制备所得的5F对照品分别用四种展开剂展开，在紫外灯下检视均只有 单一斑点，用显色剂显色，也只有单一斑点，表明实验 物质为单一成分的化合物。

 在HPLC分析中，单独用紫外检测器，可以检测 出5F以及其它具有紫外吸收的杂质，但是4F没有紫 外吸收，在紫外检测器中不能产生色谱峰，因此要确定 制备的5F中是否含有4F，还需用质谱检测器确认。 本实验中，质谱总离子流仅有一个离子峰，离子质荷比 为331(5F)，质荷比333(4F)的离子峰几乎和噪声信 号相当，表明样品为单一的5F成分。

 3 结论

 所制备的5F对照品经TI C和HPI C—MS确认 为单一化合物，采用峰面积归一化法计算纯度为 99．2 ，达到了对照品的要求，可用于半边旗中5F的 含量测定，这对于半边旗药材及以5F为主要成分的 药物制剂的开发应用提供了可靠依据。